嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化cd138靶向性的nkt细胞及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ及其基因和重组表达载体、工程化CD138靶向性的NKT 细胞（CAR138-2-NKT细胞）及其应用。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（NKT)是一种特殊类型的T淋巴细胞亚群，具有T细胞和NK细胞细 胞两重性质。NKT细胞能表达T细胞的TCR与NK细胞的NKR-Pl两种受体，在TCR和NKR介导 下，NKT细胞能够产生大量的IL-4及INF γ，对肿瘤细胞发挥细胞杀伤作用。NKT细胞通过自 身表面的⑶16与特异性抗体的Fc段结合，发挥ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)作用。但在抗体依赖的细胞介导的杀伤作用过程中，由于抗体能与革El细胞上 的相应抗原表位特异性结合，NKT细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，因此抗体与靶细 胞上的抗原结合是特异性的，但NKT细胞对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。另外，通常情 况下，输注的NKT细胞在患者体内半衰期为2周左右，有效期短暂，需要反复多次输注。另 外，NKT细胞本身缺少特异性抗体，不足以在肿瘤周围或者瘤巢中富集，制约了 NKT细胞对 恶性肿瘤的靶向治疗。而且，研究表明，NKT细胞不是对所有的肿瘤都有杀伤效果，对部分 肿瘤的杀伤作用比较弱，特异杀伤活性有待提高。
[0003] 多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM)是浆细胞异常增生的B细胞恶性肿瘤，以 骨髓中积聚大量的恶性浆细胞并分泌单克隆免疫球蛋白为特征。骨髓瘤细胞表面表达一 系列的粘附分子如CD138。CD138是一种属于跨膜粘蛋白聚糖家族成员，与骨髓微环境中的 生长因子和基质成分相结合，介导多发性骨髓瘤细胞的粘附和归巢。随着对CD138研究的 逐步深入，人们发现CD138在机体的损伤修复及肿瘤的生长、迀移中都起了关键作用。目前 CD138被认为是浆细胞最特异的表面标志物，研究显示，CD138分子在B细胞恶性肿瘤中的 表达非常复杂，在MM患者骨髓和外周血中的浆细胞表达，而骨髓中的造血前体细胞或淋巴 细胞不表达。CD138分子水平的升高可以作为骨髓瘤预后不良的有效指标，并且当MM细胞 呈现凋亡时，膜表面CD138分子表达下调或丢失，可反映 MM患者体内肿瘤细胞的负荷。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术中NKT细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀 伤活性有待提高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体⑶138ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ及其基因 和重组表达载体、工程化⑶138靶向性的NKT细胞（CAR138-2-NKT细胞）及其应用，嵌合抗 原受体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞在治疗CD138阳性的多发性骨髓瘤 时，对骨髓瘤细胞具有一定的特异杀伤活性。
[0005] 本发明的发明人在研究中意外发现，本发明的嵌合抗原受体 ⑶138ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的 CAR138-2-NKT细胞在体外有高效的杀瘤活性，同时采用CAR138-2-NKT细胞治疗⑶138阳性 的多发性骨髓瘤时，对骨髓瘤细胞具有一定的特异杀伤活性。
[0006] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为 CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD138 单链抗体 CD138ScFv-2、CD8 的铰链 区（hinge区）和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3 ζ的胞内信号结构域串联构成， 编码所述CD138ScFv-2的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0007] 第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。
[0008] 第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。
[0009] 第四方面，本发明提供了一种工程化⑶138靶向性的NKT细胞，所述NKT细胞是上 述嵌合抗原受体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT细胞。
[0010] 第五方面，本发明提供了上述工程化⑶138靶向性的NKT细胞在制备用于治疗肿 瘤的制剂中的应用。
[0011] 在治疗CD138阳性的多发性骨髓瘤时，本发明的嵌合抗原受体 ⑶138ScFv-2-⑶8-⑶137-⑶3 ζ对NKT细胞具有高的感染效率，且感染后得到的 CAR138-2-NKT细胞，即工程化⑶138靶向性的NKT细胞，能够特异性结合⑶138抗原，在 体外具有高效的杀瘤活性，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞靶向 识别骨髓瘤细胞CD138抗原的能力，加强对骨髓瘤细胞的特异杀伤活性。本发明的工程化 CD 138靶向性的NKT细胞为治疗CD 138阳性的多发性骨髓瘤提供了 一种新的选择，具有良好 的产业应用前景。
[0012] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【附图说明】
[0013] 图1为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析的结果。
[0014] 图2为本发明的慢病毒表达载体pWPT-⑶8-⑶137-⑶3 ζ的限制性内切酶MluI/ Sail双酶切片段的电泳鉴定图。
[0015] 图3为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的限制性 内切酶BamHI/Sall双酶切片段的电泳鉴定图。
[0016] 图4为本发明的慢病毒表达载体pWPT-CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的结构示 意图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。
[0017] 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的病毒 浓缩液对NKT细胞的感染效率。
[0018] 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的NKT 细胞（CAR138-2-NKT细胞）表型鉴定的结果。
[0019] 图7为本发明的CAR138-2-NKT细胞对人多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用的细胞毒 性分析图。
【具体实施方式】
[0020] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0021] 本发明提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ，由 CD138 单链抗体 CD138ScFv-2、CD8 的铰链区和跨膜区、 ⑶137的胞内信号结构域和⑶3 ζ的胞内信号结构域串联构成，编码⑶138ScFv-2的基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0022] 本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受 体的基因的核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0023] 本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ修饰的 NKT细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0024] 对于慢病毒表达载体pWPT-CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3 ζ的制备方法没有特 别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWPT-CD138ScFv-2-CD8-CD137-CD3G的制备方法包括以下步骤：
[0025] (1)从NKT细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和CD3G的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到 pWPT-CD8-CD137-CD3G ;
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