一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用
【专利摘要】本发明提供了一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及应用，使用本发明的方法可以快速构建针对不同肿瘤抗原的新一代CAR(嵌合抗原受体)载体。利用本发明制备的针对CD19分子的新一代CAR?T细胞对CD19阳性肿瘤细胞显现出明显的杀伤效果。
【专利说明】
一种嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体的方法及 应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种嵌合抗原受体、以及快速构 建嵌合抗原受体的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 在国际上，一种新型的过继细胞免疫治疗技术异军突起，这就是应用嵌合抗原受 体基因修饰的T细胞过继性地靶向性治疗肿瘤的研究，该研究在临床上取得了非常显著的 进展。
[0003] 嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR)基因修饰的T淋巴细胞（以下 简称CAR-T细胞）技术是一种非常有前景的新的ACI (基于T细胞的过继性细胞免疫治疗， adoptive cellular immunotherapy),其突出特点是高度特异性、非组织相容性抗原（MHC) 限制性及强烈而持久的杀瘤效应。多种肿瘤细胞表面表达特异性抗原，这也就为CAR-T细 胞技术提供了良好的免疫治疗靶点。
[0004] CAR的结构分为胞外抗原接合区、绞链区、跨膜区和胞内信号区，其抗肿瘤效应依 赖于胞外抗原结合区的靶向性、绞链区的灵活性、胞内信号区供刺激分子及T细胞活化序 列的协同作用。由于CAR的抗肿瘤效应受到多方面的限制，因此，本领域技术人员致力于开 发新型的具有更强的杀伤效果的CAR-T技术，以用于肿瘤等疾病的治疗和预防。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供嵌合抗原受体、以及快速构建嵌合抗原受体载体的方法及 应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种嵌合抗原受体（CAR)，所述嵌合抗原受体具有式 la、或式lb所述结构：
[0007] A-B-C-D(Ia)，或
[0008] A-C-B-D(Ib),
[0009] 其中，
[0010] A为Fc来源的多肽元件；
[0011] B为⑶28来源的多肽元件；
[0012] C为⑶137来源的多肽元件；
[0013] D为⑶3 δ来源的多肽元件；
[0014] " "表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
[0015] 在另一优选例中，所述多肽元件Α选自下组：
[0016] ㈧具有SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的多肽；
[0017] (B)具有与SEQ ID N0:2中任一所示氨基酸序列彡80 %同源性（优选地，彡90% 的同源性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽；
[0018] (C)将SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽。
[0019] 在另一优选例中，所述多肽元件B选自下组：
[0020] ㈧具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽；
[0021] (B)具有与SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列彡80 %同源性（优选地，彡90% 的同源性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽；
[0022] (C)将SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的衍生多肽。
[0023] 在另一优选例中，所述多肽元件C选自下组：
[0024] (A)具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的多肽；
[0025] (B)具有与SEQ ID N0:6所示氨基酸序列彡80 %同源性（优选地，彡90 %的同源 性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽；
[0026] (C)将SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽。
[0027] 在另一优选例中，所述多肽元件C的长度为30-50个氨基酸残基，优选为42个氨 基酸。
[0028] 在另一优选例中，所述多肽元件D选自下组：
[0029] (A)具有SEQ ID N0:8所示氨基酸序列的多肽；
[0030] (B)具有与SEQ ID N0:8所示氨基酸序列彡80 %同源性（优选地，彡90 %的同源 性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽；
[0031] (C)将SEQ ID N0:8所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的衍生多肽。
[0032] 在另一优选例中，所述多肽元件D的长度为80-120个氨基酸残基，优选为112个 氣基酸残基。
[0033] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 10所示。
[0034] 在另一优选例中，将所述嵌合抗原受体表达于T细胞时，所述T细胞具有以下特 性：
[0035] a)具有特异性杀伤肿瘤细胞的能力；
[0036] b)诱导杀伤性细胞因子产生的能力；
[0037] c)对肿瘤细胞的杀伤不依赖于MHC的表达；和/或
[0038] d)具有较长的体内存活时间。
[0039] 在另一优选例中，所述多肽元件A的外侧连接有单克隆抗体。
[0040] 在另一优选例中，所述单克隆抗体特异性的识别肿瘤标志性抗原。
[0041] 在另一优选例中，所述单克隆抗体为单链抗体（seFv)。
[0042] 在另一优选例中，所述单克隆抗体为抗CD19单克隆抗体。
[0043] 在另一优选例中，所述多肽元件A和所述单克隆抗体之间由肽接头连接，优选地， 所述肽接头长度为2-5个氨基酸。
[0044] 本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第一 方面所述的嵌合抗原受体。
[0045] 在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
[0046] (a)编码如SEQ ID N0. : 10所示多肽的多核苷酸；
[0047] (b)序列如SEQ ID N0. : 9所示的多核苷酸；
[0048] (c)核苷酸序列与（b)所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )的多核苷酸；
[0049] (d)如（b)所示多核苷酸的5'端和/或3'端截短或添加1-60个（较佳地1-30， 更佳地卜1〇个）核苷酸的多核苷酸；
[0050] (e)与（a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0051] 在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
[0052] 本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体包括本发明第二方面所述的多核 苷酸。
[0053] 在另一优选例中，所述载体选自：慢病毒载体、逆转录病毒载体、和睡美人表达系 统。
[0054] 在另一优选例中，所述载体以cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体为骨架。
[0055] 本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达本发明第一方面所 述的嵌合抗原受体；和/或
[0056] 所述宿主细胞基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸；和/或
[0057] 所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体。
[0058] 在另一优选例中，所述宿主细胞为T细胞，或含有T细胞的细胞群。
[0059] 本发明的第五方面，提供了一种制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，包括步 骤：
[0060] 在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而制备出嵌合抗 原受体修饰的τ细胞。
[0061] 在另一优选例中，所述方法包括步骤：
[0062] (1)构建慢病毒载体
[0063] 所述慢病毒载体包含式II所示的核苷酸序列：
[0064] e-i II
[0065] i为编码本发明第一方面所述的CAR的核苷酸序列，
[0066] e为编码抗体的核苷酸序列，
[0067] e连接于多肽元件A的编码序列的外侧；
[0068] (2)慢病毒包装
[0069] 将步骤（1)的慢病毒载体,用慢病毒包装系统和293T细胞进行慢病毒包装，收获 病毒液，
[0070] 所述慢病毒包装系统包括质粒：Rev质粒、VSV-G质粒、和Λ R质粒；
[0071] (3) Τ细胞转染
[0072] 将步骤（2)获得病毒液浓缩后转染Τ细胞，即获得所述嵌合抗原受体修饰的Τ细 胞。
[0073] 在另一优选例中，所述抗体为单链抗体。
[0074] 在另一优选例中，所述单链抗体为特异性识别肿瘤抗原的抗体。
[0075] 在另一优选例中，所述抗原为⑶19。
[0076] 在另一优选例中，e具有SEQ ID NO. : 11所不的核苷酸序列。
[0077] 在另一优选例中，i具有SEQ ID N0. :9所示的核苷酸序列。
[0078] 本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含：本发明第一方面所 述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、或者本 发明第四方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0079] 本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明
[0080] 第二方面所述的分离的多核苷酸的用途，
[0081] (1)用于制备治疗肿瘤的药物；和/或
[0082] (2)用于制备嵌合抗原受体修饰的T细胞。
[0083] 在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小 肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿 瘤。
[0084] 本发明的第九方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用本 发明第四方面所述的宿主细胞。
[0085] 在另一优选例中，所述的对象是人。
[0086] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0087] 图 1 为 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段和 cdh-cmv-efl-copgfp 载体酶切图（Ecorl/ Notl双酶切）。
[0088] 其中泳道1和2代表Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ片段从T载体上切下来的酶切图，泳 道3和4代表cdh-cmv-efl-copgfp载体的酶切图。
[0089] 图 2 为 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段连接到 cdh-cmv-efl-copgfp 载体上的菌检图。 共挑了 10个克隆菌检，菌检到6个阳性克隆，送公司测序，测序正确。Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体构建成功。
[0090] 图3为用overlap PCR扩增得到的⑶19单链抗体序列（VH-1 inker-VL)。
[0091] 图 4 为 CD19 单链抗体序列插入到 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢 病毒载体的菌检图。挑了 18个克隆菌检，共检测到9个阳性克隆，挑取三个送公司测序，测 序正确，新一代⑶19-CAR载体构建成功。
[0092] 图5为流式细胞术检测的利用本发明构建的新一代CD19-CAR载体在T细胞表面 上的表达情况。结果显示有30%的细胞是Fc与GFP(慢病毒载体本身表达GFP蛋白）双阳 性，说明利用本发明构建的新一代⑶19-CAR能够在T细胞表面表达，且转染效率为30%。
[0093] 图6所示为我们构建的新一代（三代）⑶19-CAR-T细胞对⑶19阳性套式淋巴瘤 细胞的杀伤结果。结果显示未被基因修饰的T细胞对Jeko-Ι和Maver-Ι细胞的杀伤效率 分别为30%和32%，第二代⑶19-CAR-T细胞（只含有⑶28 -个共刺激因子，没有⑶137 共刺激因子）对上述2种肿瘤细胞的杀伤效率分别为50%和60%，而我们构建的新一代 ⑶19-CAR-T细胞对上述2种肿瘤细胞的杀伤效率分别高达78%和75%。而未被基因修饰 的T细胞与第二代⑶19-CAR-T细胞及新一代⑶19-CAR-T细胞对293T细胞（⑶19阴性细 胞系）的杀伤效率没有显著差别（13%，25%，24%)。结果显示利用本发明构建的新一代 ⑶19-CAR-T细胞比第二代⑶19-CAR-T细胞对⑶19阳性肿瘤细胞具有更强的杀伤效果。
【具体实施方式】
[0094] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种具有较高杀伤能力的新一代嵌合抗原 受体（CAR)，表达该嵌合抗原受体的T细胞其具有显著的抗肿瘤效应。本发明还提供了一种 速构建该新一代CAR的方法。
[0095] 嵌合抗原受体（CAR)
[0096] 过继细胞免疫治疗技术（adoptive cellular immunotherapy)是应用嵌合抗原受 体基因修饰的T细胞过继性地靶向性治疗肿瘤的技术。该技术在临床上取得了非常显著的 进展。最为代表性的是以⑶19为靶向的CAR-T细胞治疗⑶19阳性的B细胞白血病和淋巴 瘤的基础和临床研究。
[0097] CAR-T细胞治疗的关键在于构建能够靶向肿瘤相关抗原的嵌合抗原受体（CAR)， 该嵌合抗原受体主要由识别靶向分子的膜外片段，连接片段，和胞内传递信号及效应分子 的膜内片段组成。膜外片段主要来源于抗原特异性的抗体重链和轻链可变区片段由中间连 接分子相连组成的单链抗体（scFV)组成，中间片段是由Fc来源的连接和穿膜片段组成，膜 内片段由传递信号及效应分子主要如CD3 δ组成。
[0098] 一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有式la、或式lb 所述结构：
[0099] A-B-C-D(Ia)，或
[0100] A-C-B-D(Ib),
[0101] 其中，
[0102] A为Fc来源的多肽元件；
[0103] B为⑶28来源的多肽元件；
[0104] C为⑶137来源的多肽元件；
[0105] D为⑶3 δ来源的多肽元件；
[0106] " "表示连接上述各元件的肽键或肽接头。
[0107] 在优选地实施方式中，多肽元件Α为Fc胞外区序列，其氨基酸序列为：
[0109] 其编码核苷酸序列为：
[0111] 在优选地实施方式中，多肽元件B为CD28跨膜区及胞内区序列，其氨基酸序列 为：
[0113] 其编码核苷酸序列为：
[0115] 在优选地实施方式中，多肽元件C为CD137胞内区序列，其氨基酸序列为：
[0117] 其编码核苷酸序列为：
[0119] 在优选地实施方式中，多肽元件D为⑶3 δ胞内区序列，其氨基酸序列为：
[0121] 其编码核苷酸序列为：
[0123] 在优选地实施方式中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列（新一代CAR完整序列） 为：
[0125] 其编码核苷酸序列为：
[0127] 如本文所用，术语"嵌合抗原受体"还包括具有上述活性的、SEQ ID NO :10序列的 变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1-3个（通常为1-2个，更佳地1个）氨基 酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个（通常为3 个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内）氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或 相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括 单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽（如环肽）。
[0128] 本发明还包括上述嵌合抗原受体的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语 "片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明嵌合抗原受体的功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是（i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基 (优选保守性氨基酸残基）被取代的多肽，或（i i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基 团的多肽，或（i i i)抗原肽与另一个化合物（比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二 醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽（与前 导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的嵌合抗原受体）。根据本文的教导，这些 片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0129] 一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多5 个，更佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变 异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
[0130] 表 A
[0131]
[0133] 本发明还提供本发明嵌合抗原受体的类似物。这些类似物与SEQ ID NO: 10所示 的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或 者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基（如D-氨基酸）的类似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、Y-氨基酸）的类似物。应理解，本发明的 多肽并不限于上述例举的代表性的多肽，这些而多肽均落入本发明权利要求的保护范围之 内。
[0134] 修饰（通常不改变一级结构）形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶（如哺乳动 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基（如磷酸酪 氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸）的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优 化了溶解性能的多肽。
[0135] 另一方面，本发明提供了一种可以快速构建针对不同肿瘤抗原的CAR载体，包括 步骤：将本发明的嵌合抗原受体（Fc-CD28-CD137-CD3 δ )片段克隆到cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒载体上。当需要构建针对不同肿瘤抗原的CAR载体时，只需把靶向肿瘤抗原的相应 单链抗体序列插入这个载体就可以了，不需要再从头开始繁琐的一步步克隆，能大大的节 约时间和实验成本。
[0136] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质， 原始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化 的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0137] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0138] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋 白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然 发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域 所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失 或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0139] 如本文所用，术语"引物"指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为 起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可 以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大 致上"（或"基本上"）与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一 条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3' 端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板 互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引 物-模板复合物，从而进行扩增。
[0140] 本发明嵌合抗原受体或其元件的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增 法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤 其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方 法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多 次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0141] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0142] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0143] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引 物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方 法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0144] 本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或嵌合抗原受 体编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
[0145] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组 蛋白。一般来说有以下步骤：
[0146] (1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸 的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0147] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0148] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0149] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内 重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0150] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0151] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0152] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞，优选为T细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细 胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NSO、C0S7、或293细胞的 动物细胞等。
[0153] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用0 &(：12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的 方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方 法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0154] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0155] 在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是 本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀 剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、 离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0156] 抗体
[0157] 本发明中，"抗体"可互换使用，是指对本发明蛋白具有特异性的多克隆抗体和单 克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，"特异性"是指抗体能分别结合于本发明蛋白或其片 段。较佳地，指那些能与本发明蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的 抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
[0158] 本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片 段，如Fab'或（Fab) 2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗 体。
[0159] 肤接头
[0160] 本发明提供了一种嵌合抗原受体，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性 可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋 白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对 嵌合抗原受体的稳定性的影响。
[0161] 连接肽的长度一般为0-10个氨基酸,较佳地1-5个氨基酸。
[0162] 药物组合物及施用方法
[0163] 本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的本发明的嵌合抗原受体或表达该嵌 合抗原受体的宿主细胞，以及药学上可接受的载体。通常，可将本发明的嵌合抗原受体或表 达该嵌合抗原受体的宿主细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中， 其中pH通常约为5-8,较佳地，pH约为6-8。
[0164] 如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或 活性的且可被人和/或动物所接受的量，如0. 〇〇l-99wt% ;较佳的0. 01-95wt% ;更佳的， 0. l-90wt%。
[0165] 如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上 可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0166] 本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的嵌合抗原受体或表达该嵌合抗 原受体的宿主细胞以及药学上可接受的载体。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合 物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法 进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本 发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
[0167] 本发明嵌合抗原受体或表达该嵌合抗原受体的宿主细胞的有效量可随给药的模 式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人 员根据各种因素来确定（例如通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：本发明嵌合抗 原受体或表达该嵌合抗原受体的宿主细胞的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰 期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。针 对肿瘤患者，通常，当本发明的嵌合抗原受体或表达该嵌合抗原受体的宿主细胞每天以约 0. 5mg-5mg/kg动物体重（较佳的2mg-4mg/kg动物体重）的剂量给予，能得到令人满意的效 果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0168] 本发明的主要优点在于：
[0169] 1.本发明提供了一种新一代的CAR，表达该CAR的CAR-T细胞，具有较高细胞杀伤 能力。
[0170] 2.本发明提供了能够快速构建新一代CAR的载体，以及能够快速构建新一代CAR 的方法。
[0171] 3.利用本发明能快速制备靶向特定肿瘤抗原的新一代CAR-T细胞，使用本发明的 CAR载体在T细胞表面进行表达，转染效率高达30 %。
[0172] 4.利用本发明制备的新一代⑶19-CAR-T细胞对⑶19阳性淋巴瘤细胞具有明显的 杀伤作用。
[0173] 5.本发明构建的新一代CAR载体除了可以在慢病毒载体上表达，还可以构建到逆 转录病毒载体及睡美人表达系统中。
[0174] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获 得。
[0175] 材料和方法
[0176] 1.酶切方法：
[0177] 按表1配成50ul反应体系，37°C酶切3至6小时，酶切后跑琼脂糖凝胶电泳，用 AXYGEN的DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。
[0178] 表 1
[0179]
[0180] 2.连接方法：
[0181] 按表2配成20ul反应体系，16°C连接8小时后，将连接产物进行转化进行转化。
[0182] 表 2
[0183]
[0184] 3.转化方法：
[0185] ⑴分别在1管100 μ 1的DH5a大肠杆菌感受态细胞中加入l_2ul质粒，轻轻旋转 以混匀内溶物，冰浴30min ;
[0186] ⑵将离心管放至42°C的循环水浴中热激90s ;
[0187] ⑶快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却至室温；
[0188] ⑷每管加800 μ 1 LB液体培养基，37°C摇床中200r/min摇45min ;
[0189] (5)取200ul转化的感受态细胞，分别转移到含相应抗生素的LB固体培养基上，用 一无菌的弯头玻璃棒将菌液涂满整个平板表面；
[0190] (6)将平板置于超净台中直至平板表面菌液被吸收；
[0191] (7)封好平皿，倒置于37°C培养，12_16h。
[0192] 4.菌检方法：
[0193] 用枪头从转化好的平板中挑取单克隆于10ul的LB培养基中混匀，每个平板可以 挑取6-10个克隆。以挑取的单克隆为模板进行PCR，菌检PCR体系（25ul体系）如下：
[0194]
[0195] 反应条件：95°C 5min，25 个循环（95°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin)，最后 72°C 孵育7min。
[0196] 将菌检是阳性的克隆的菌液或质粒送公司测序。
[0197] cdh-cmv-ef 1-copgfp慢病毒载体菌检引物：
[0198] 引物 1 序列为：5' -ACGGTGGGAGGTCTATATAAGCA-3' (SEQ ID NO. :11);
[0199] 引物 2 序列为：5' -GCCGACCCCTCCCCCCAACTTCT-3' （SEQ ID NO. :12)。
[0200] 5、T细胞制备及激活方法：
[0201] 抽取健康人外周血，用Ficoll-Paque Plus试剂从外周血中分离得到淋巴细胞。将 lX106/ml淋巴细胞置于10% FBS的RPMI 1640完全培养基中，每7天加入100ul的人类 淋巴细胞激活扩增试剂（由博生吉医药科技（苏州）有限公司提供），每2天加入100IU/ ml几-2,5%0)2,371：条件下培养。刺激3天后，可以看到细胞成聚团现象，显示细胞已经 被活化，活化的细胞可以用来进行慢病毒的转染。
[0202] 6、细胞毒性实验方法：
[0203] 选用两组细胞，一组为⑶19阳性肿瘤细胞：Maver-l、Jeko-Ι，一组为⑶19阴性肿 瘤细胞：293T细胞。效应细胞分别为CAR-T细胞和未被基因修饰的T细胞。设置效靶比 5:1，杀伤时间为12h。用CFSE(购自Life technologies公司）标记上述4种肿瘤细胞，向 每孔中分别加入效应T细胞。12h后，收集细胞，加入7-ADD抗体（购自BD公司）进行流式 检测。
[0204] 实施例1FC-CD28-CD137-CD3 δ片段-慢病毒载体的构建
[0205] 将人Fc胞外区序列（SEQ ID NO. : 2)，CD28跨膜区及胞内区序列（SEQ ID N0. :4)，CD137 胞内区序列（SEQ ID NO. :6)及 0)3δ 胞内区序列（SEQ ID NO. :8)按Fc-CD28-CD137-CD3 δ的顺序基因合成，两端加 EcoRI和Notl的酶切 位点。Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ基因合成好后用EcoRI和Notl酶将片段酶切下来， cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体（购自Addgene公司，在EcoRI酶切位点前面还有两个 酶切位点（乂&&1，他61))也用相同的酶进行酶切，将？〇402840137403 3片段克隆到 cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒载体上，得到了 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒重组载体。
[0206] 因为cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体上EcoRI酶切位点前面还有两个酶切位点 (Xbal，Nhel)，这样能够方便地构建针对不同免疫原的各种CAR载体，只需把需要的单链抗 体序列直接插入这其中的两个酶切位点的位置就可以了。
[0207] 将上述Fc-CD28-CD137-CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒重组载体转化到大肠 杆囷中，培养后囷检。
[0208] 图 1 为 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段和 cdh-cmv-efl-copgfp 载体酶切图（Ecorl/ Notl双酶切）。其中泳道1和2代表Fc-⑶28-⑶137-⑶3 δ片段从T载体上切下来的酶切 图，泳道3和4代表cdh-cmv-efl-copgfp载体的酶切图。
[0209] 图 2 为 Fc-CD28-CD137_CD3 δ 片段连接到 cdh-cmv-efl-copgfp 载体上的菌检图。 共挑了 10个克隆菌检，菌检到6个阳性克隆，经测序，序列与预期一致，说明本实施例中成 功构建了 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒载体。
[0210] 实施例2新一代⑶19-CAR载体的构建
[0211] CD19单链抗体序列的重链和轻链可变区序列来自于鼠抗人CD19单克隆抗体杂交 瘤细胞（PGC3D6H10单克隆抗体，中国专利申请：201510016959. 9)。将VH(CD19单抗重链 可变区序列），Linker序列，VL(⑶19单抗轻链可变区序列）按顺序用overlap PCR方法 得到一条CD19单链抗体序列（引物两端含有Xbal和Ecorl酶切位点，用于直接亚克隆到 Fc-CD28-CD137-CD3 δ片段-cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体上），将CD19单链抗体片段 和 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢病毒载体分被用 Xbal 和 Ecorl 酶切后， 进行连接，转化，菌检，测序，⑶19-CAR-cdh-cmv-efl-copgfp慢病毒载体构建完成。
[0212] 图3为用overlap PCR扩增得到的⑶19单链抗体序列（VH-1 inker-VL)。
[0213] 图 4 为 CD19 单链抗体序列插入到 Fc_CD28-CD137_CD3 δ -cdh-cmv-efl-copgfp 慢 病毒载体的菌检图。挑选18个克隆进行菌检，共检测到9个阳性克隆，挑取三个送公司测 序，测序正确，新一代⑶19-CAR载体（第三代⑶19-CAR载体）构建成功。
[0214] ⑶19单链抗体编码序列如下：
[0216] 实施例3新一代⑶19-CAR-T细胞的制备及对肿瘤细胞的杀伤检测
[0217] 将得到的新一代⑶19-CAR-T慢病毒载体用三质粒（Rev质粒（购自Addgene公 司）、VSV-G质粒（购自Addgene公司）和Λ R质粒（购自Addgene公司））包装系统和 293T细胞（购自ATCC细胞库）进行慢病毒的包装。收获病毒后浓缩，获得浓缩过的新一代 CD19-CAR-cdh-cmv_ef Ι-copgfp 病毒液。
[0218] 病毒浓缩后进行T细胞的转染。利用Ficoll-Paque Plus试剂（购自GE Healthcare公司）从外周血中分离得到PBMC。T细胞经活化后，取出1X106个细胞，加入浓 缩过的新一代⑶19-CAR-cdh-cmv-efl-copgfp病毒液，混匀，Μ0Ι = 30。一周后对转染的T 细胞进行相关目的蛋白的检测。
[0219] 图5为流式细胞术检测的利用本发明构建的新一代CD19-CAR载体在T细胞表面 上的表达情况。图5中左图显示了未转染新一代⑶19-CAR载体的T细胞的流式检测图；右 图显示了转染了新一代CD19-CAR载体的T细胞流式检测图。结果表明有30%的细胞是Fc 与GFP(慢病毒载体本身表达GFP蛋白）双阳性，说明利用本发明构建的新一代CD19-CAR 能够在T细胞表面表达，且转染效率为30%。
[0220] 使用本发明的表达新一代⑶19-CAR的T细胞，进行细胞毒性实验。
[0221] 图6为本发明构建的新一代⑶19-CAR-T细胞对⑶19阳性套式淋巴瘤细胞（细胞 株编号：CRL-3006?，CRL-3008?，购自美国ATCC细胞库，）的杀伤结果。结果显示未被基因 修饰的T细胞对Jeko-Ι和Maver-Ι细胞的杀伤效率分别为30%和32%。
[0222] 作为对照的第二代⑶19-CAR-T细胞（只含有⑶28 -个共刺激因子，没有⑶137 共刺激因子，其余结构同本发明的新一代CD19-CAR-T细胞，制备方法同上）对上述2种肿 瘤细胞的杀伤效率分别为50%和60%，而本发明中构建的新一代⑶19-CAR-T细胞对上 述2种肿瘤细胞的杀伤效率分别高达78%和75%。而未被基因修饰的T细胞与第二代 ⑶19-CAR-T细胞及新一代⑶19-CAR-T细胞对293T细胞（⑶19阴性细胞系）的杀伤效率没 有显著差别（13%，25%，24%)。结果显示利用本发明构建的新一代⑶19-CAR-T细胞比第 二代⑶19-CAR-T细胞对⑶19阳性肿瘤细胞具有更强的杀伤效果，与第二代⑶19-CAR-T细 胞对照组相比，杀伤效率提高了 50%以上。
[0223] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种嵌合抗原受体（CAR)，其特征在于，所述嵌合抗原受体具有式la、或式lb所述结 构： A_B_C_D(la)，或 A-C-B-D(Ib)， 其中， A为Fc来源的多肽元件； B为⑶28来源的多肽元件； C为⑶137来源的多肽元件； D为⑶3 δ来源的多肽元件； 表示连接上述各元件的肽键或肽接头。2. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述多肽元件Α选自下组： (A) 具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有与SEQ ID NO: 2中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡90%的同 源性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 将SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件B选自下组： (A) 具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有与SEQ ID NO:4中任一所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡90%的同 源性；等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 将SEQ ID N0:4中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件C选自下组： (A) 具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有与SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡90%的同源性； 等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 将SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的衍生多肽；和/或 所述多肽元件D选自下组： (A) 具有SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的多肽； (B) 具有与SEQ ID NO: 8所示氨基酸序列彡80%同源性（优选地，彡90%的同源性； 等优选地彡95%的同源性；最优选地，彡97%的同源性）的多肽； (C) 将SEQ ID N0:8所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的衍生多肽。3. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列 如 SEQ ID NO. :10 所示。4. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述多肽元件A的外侧还连接有单 克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体为抗CD19单克隆抗体。5. -种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的嵌合抗原 受体。6. -种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求5所述的多核苷酸； 优选地，所述载体选自：慢病毒载体、逆转录病毒载体、和睡美人表达系统。7. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；和 /或 所述宿主细胞基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸；和/或 所述宿主细胞含有权利要求6所述的载体。8. -种制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，其特征在于，包括步骤： 在适合表达的条件下，培养表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的T细胞，从而制备出 所述嵌合抗原受体修饰的T细胞； 优选地，所述方法包括步骤： (1) 构建慢病毒载体 所述慢病毒载体包含式II所示的核苷酸序列： e-i II i为编码权利要求1所述的CAR的核苷酸序列， e为编码抗体的核苷酸序列， e连接于多肽元件A的编码序列的外侧； (2) 慢病毒包装 将步骤（1)的慢病毒载体，用慢病毒包装系统和293T细胞进行慢病毒包装，收获病毒 液， 所述慢病毒包装系统包括质粒：Rev质粒、VSV-G质粒、和Λ R质粒； (3) Τ细胞转染 将步骤（2)获得病毒液浓缩后转染Τ细胞，即获得所述嵌合抗原受体修饰的Τ细胞。9. 一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包含：权利要求1所述的嵌合抗原受体、 权利要求5所述的多核苷酸、权利要求6所述的载体、或者权利要求7所述的宿主细胞，以 及药学上可接受的载体或赋形剂。10. 权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的分离的多核苷酸 的用途， (1) 用于制备治疗肿瘤的药物；和/或 (2) 用于制备嵌合抗原受体修饰的Τ细胞。
【文档编号】C12N5/10GK105985444SQ201510061635
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月5日
【发明人】杨林, 游凤涛, 姜丽翠
【申请人】博生吉医药科技(苏州)有限公司