一种针对肿瘤干细胞的嵌合抗原受体t细胞的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种针对肿瘤干细胞的嵌合抗原受体。
【背景技术】
[0002]嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor T-Cell，CAR_T)是一种新发展起来的治疗肿瘤的细胞治疗技术。这种治疗方式特异性高、效果好，受到了医学界的重视。CAR-T的构成原理是，将能识别某种肿瘤抗原的抗体的抗原结合部scFv( single-chainvariable fragments，scFv))，与免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activat1n motifs，ITAM，通常为⑶3_ζ和FceRI γ )的胞内部分在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染患者的T细胞，使其表达嵌合抗原受体(CAR)。患者的T细胞被“重编码”后，生成大量肿瘤特异性的CAR-T细胞。
[0003]目前CAR-T淋巴细胞技术已经发展到了第三代，第一代CAR由识别肿瘤表面抗原的单链抗体(single chain fragment variable，scFv)和免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activat1n motifs，ITAM，通常为CD3_G和FceRI γ )组成。早期的实验证明了 CAR-T的可行性，然而第一代CAR只能引起短暂的T细胞增值和较低的细胞因子分泌，不能提供长时间的T细胞扩增信号和持续的体内抗肿瘤效应。依照T细胞活化的双信号学说，T细胞的激活和增殖需要共刺激信号。
[0004]第二代CAR的胞内信号转导区引入了共刺激因子，主要为CD28分子，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、INF-γ以及GM-CSF增加，从而突破了肿瘤微环境的免疫抑制，延长了 AICD，第三代CAR在第二代的基础上，增加了另外一种共刺激因子的胞内结构域，主要为⑶134(0Χ-40)或⑶137(4-1ΒΒ)等，旨在提高T细胞的细胞毒活性、增殖性与存活时间，促进细胞因子的释放。
[0005]现有CAR-T存在的优点如下:
1、精准:嵌合的抗体中的抗原结合部可高效识别肿瘤抗原，精准杀灭；
2、高效:CAR-T细胞可不通过抗原呈递细胞途径既能实现高效识别肿瘤细胞；
多样:CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围。
[0006]然而现有CAR-T技术同样存在较大的缺点:
1、缺乏特异性抗原:由于一个CAR结构只识别一种抗原，而目前肿瘤特异性抗原很少，所以限制了 CAR-T的应用；
2、存在误杀:由于缺少肿瘤特异性抗原，所以，一旦使用非特异性抗原制备抗体，CAR-T输入人体后存在误杀的可能性，从而存在引起免疫损伤。
[0007]上述缺点导致CAR-T的临床应用存在较大的安全隐患，其应用也受到了限制。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种针对肿瘤干细胞的嵌合抗原受体T细胞，可实现特异性的杀伤的肿瘤干细胞。
[0009]本发明的目的是以下述技术方案实现的:
一种针对肿瘤干细胞的嵌合抗原受体T细胞，此种T细胞嵌合了2?3个独立的抗原受体，每个嵌合的抗原受体分别由不同的肿瘤干细胞特异性标记物的抗体的抗原结合部与不同的功能蛋白结合组成，功能蛋白选自胞内免疫受体酪氨酸活化基序、共刺激因子I胞内结构域、共刺激因子2胞内结构域的一种或两种组合;细胞外抗体部分与细胞内功能蛋白通过CD3_zeta跨膜区结构连接。
[0010]所述免疫受体酪氨酸活化基序为⑶3-ζ或FceRI γ。
[0011]所述胞内共刺激因子I为⑶28分子或⑶137分子或⑶134分子中的一个。
[0012]所述胞内共刺激因子2为与共刺激分子I不同的⑶28分子或⑶137分子或⑶134分子中的一个。
[0013]所述肿瘤干细胞为胰腺癌干细胞，特异性标记物为⑶24+、⑶44+和⑶133+。
[0014]此种T细胞嵌合了3个独立的抗原受体，抗原受体I由CD24抗体的ScFv和胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成;抗原受体2由CD44抗体的ScFv和胞内共刺激因子I胞内结构域组成;抗原受体3由CDl 33抗体的ScFv和胞内共刺激因子2胞内结构域组成;细胞外抗体部分与细胞内功能蛋白通过CD3_zeta跨膜区结构连接。
[0015]所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞，特异性标记物为⑶90+和⑶44+。
[0016]此种T细胞嵌合了2个独立的抗原受体，抗原受体I由CD90抗体的ScFv和胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成;抗原受体2由CD44抗体的ScFv、胞内共刺激因子1、胞内共刺激因子2胞内结构域组成;细胞外抗体部分与细胞内功能蛋白通过CD3_zeta跨膜区结构连接。
[0017]此种T细胞嵌合了2个独立的抗原受体，抗原受体I由CD90抗体的ScFv和胞内免疫受体酪氨酸活化基序和胞内共刺激因子I组成;抗原受体2由CD44抗体的ScFv和胞内共刺激因子2胞内结构域组成;细胞外抗体部分与细胞内功能蛋白通过CD3_zeta跨膜区结构连接。
[0018]本发明通过选择不同的肿瘤干细胞特异性标记物(抗原)的抗体的抗原结合部与不同的功能蛋白组合，构建独立的2-3个嵌合抗原受体，只有2-3个嵌合抗原受体均识别抗原后，才激活T细胞，从而实现对肿瘤干细胞的特异性杀伤，提高其安全性。
[0019]肿瘤干细胞具有极强的致瘤性，通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迀徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。目前，在血液肿瘤、乳腺癌、脑肿瘤、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌中均发现了肿瘤干细胞的存在。本发明构建的CAR-T可以特异性消灭肿瘤干细胞，消除肿瘤发展、侵袭、转移、耐药、复发的决定性因素，可对临床治疗起到积极的促进作用。
[0020]此外，此发明构建的针对肿瘤干细胞的CAR-T也可以作为肿瘤研究的有力工具，为肿瘤研究提供了新的方法:(I)用此工具消除肿瘤细胞中的干细胞后对细胞群落进行研究，以发现干细胞的有无对肿瘤细胞群落生存、发展的影响；(2)目前对一些肿瘤干细胞表面标记物的认定还未达成统一认识，可应用本发明的方法分别消除具有不同标记组合的肿瘤干细胞备选细胞后进行成瘤性等相关研究，以确认肿瘤干细胞的表面标记物。
【附图说明】
[0021 ] 图1是现有技术中CAR-T构建模型。
【具体实施方式】
[0022]—种针对肿瘤干细胞的嵌合抗原受体T细胞，此种T细胞嵌合了 2?3个独立的抗原受体，每个嵌合的抗原受体分别由不同的肿瘤干细胞特异性标记物的抗体的抗原结合部与不同的功能蛋白结合组成，功能蛋白选自胞内免疫受体酪氨酸活化基序、共刺激因子I胞内结构域、共刺激因子2胞内结构域的一种或两种组合;2个或3个抗原受体所结合的所有的功能蛋白要包括胞内免疫受体酪氨酸活化基序、共刺激因子1、共刺激因子2;细胞外抗体部分与细胞内功能蛋白通过CD3_zeta跨膜区结构连接。
[0023]所述免疫受体酪氨酸活化基序为⑶3-ζ或FceRIγ ;所述胞内共刺激因子I为⑶28分子;胞内共刺激因子I为CD28分子或CD137分子或CD134中的一个;胞内共刺激因子2为与共刺激分子I不同的⑶28分子或⑶137分子或⑶134中的一个。
[0024]—般肿瘤干细胞有2-3个标记物，采用上述方法构建CAR-T即可，但是也存在着少数多于3个标记物的肿瘤干细胞存在，可以按照上述方法制作2-3批针对不同标记物组合的新型CAR-T—起低剂量应用，如大肠癌干细胞的标记物是⑶133+24+44+以及⑶166+EpCAM+，可以制作2批分别针对⑶133+24+44+的，以及针对CD166+EpCAM+的CAR-T—起低剂量应用，CD133+24+44+CD166+EpCAM+干细胞即大肠癌干细胞上会结合2种CAR-T，即结合的CAR-T最多，因此干细胞被杀死的最多，对其他细胞可能也存在误杀，但是误杀几率较小，因为相对于单一标记物来说，这些标记物组合是肿瘤细胞才有的，二是每种CAR-T低剂量使用，即使有误杀，造成的影响也不大。
[0025]下面以胰腺癌干细胞和肝癌干细胞的嵌合抗原受体为例。
[0026]实施例1
胰腺癌干细胞的特异性标记抗原为CD24+、CD44+和CD133+，针对胰腺癌干细胞的嵌合抗原受体T细胞嵌合了 3个独立的抗原受体，3个抗原受体分别由不同标记抗原的scFv与不同的功能蛋白组成;抗原受体I由CD24抗体的ScFv和胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成，当然也可以由⑶24抗体的ScFv和选自⑶28分子或⑶137分子或⑶134任意一种共刺激因子胞内结构域组成;然后抗原受体2、抗原受体3分别与另外一种共刺激因子或胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成。
[0027]作为其中一种优选的方案为:抗原受体I由CD24抗体的ScFv和胞内免疫受体酪氨酸活化基序CD3-e组成;抗原受体2由CD44抗体的ScFv和胞内共刺激因子I胞内结构域组成；抗原受体3由CDl 33抗体的ScFv和胞内共刺激因子2胞内结构域组成。
[0028]其构建方法采用融合蛋白技术，具体步骤示例如下:
1、⑶24的嵌合抗原受体标记:应用基因技术，将⑶24抗体的scFv蛋白的编码基因与胞内免疫受体酪氨酸活化基序蛋白编码融合表达；
2、CD44的嵌合抗原受体标记:应用基因技术，将CD44抗体的scFv蛋白编码与CD28分子蛋白编码融合表达；
3、CD133的嵌合抗原受体标记:应用基因技术，将CD133抗体的scFv蛋白编码与CD134分子蛋白编码融合表达；
4、转染:应用转染技术将这些融合蛋白的基因转移进T细胞内，使得T细胞同时表达这3种融合蛋白。
[0029]上述技术具体步骤如下:
1)scFV基因片段的制备(以杂交瘤技术为例):分别从可合成目标抗原(CD133/24/44)抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA并合成cDNA(例如Promega公司试剂盒)。以cDNA为模板，以轻链可变区VL及重链可变区VH的前后引物PCR扩增全套VL和VH基因。通过两步法以VL和VH片段互为模板、引物，重叠PCR随机拼接VL和VH为单链抗体(scFv)基因片段。scFv连接到NdeI和Xho I酶切的表达载体Pe t-28a (+)上，并转入大肠杆菌No vagen公司。通过N1-NTA金属亲和层析法纯化单链抗体。利用ELISA和western-blot鉴定大肠杆菌表达的单链抗体，以确定scFV的基因序列；