一种成纤维细胞诱导分化为多功能干细胞的方法
【专利说明】一种成纤维细胞诱导分化为多功能干细胞的方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及一种成纤维细胞诱导分化为多功能干细胞的方法，具体涉及的是一种白癜风病人皮损处皮肤成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0003]白癜风(vitiligo)是一种常见的局部或全身色素脱失性皮肤病，该病发病率约为0.5-2%，临床表现为色素脱失，及白斑形成，边缘较清晰。白癜风的发病机制不是很明确，近年来研究与遗传因素、自身免疫因素、氧化应激反应、黑素细胞自身破坏以及精神神经因素等方面有关。该病治疗方法有多种，包括药物治疗、物理治疗、外科手术治疗等，但效果并不十分理想，对患者的生活造成一定影响。
[0004]用干细胞进行疾病治疗的研究近年来已有许多成果，对于白癜风的治疗也可以利用干细胞来实现。由于白癜风病人皮损处的黑素细胞功能下降甚至缺失，可以利用干细胞诱导出黑素细胞后进行相关治疗。目前诱导分化出黑素细胞的干细胞有胚胎干细胞(EScell)、缪斯细胞(Muse cell)、间充质干细胞(MSC)、诱导多功能干细胞(iPS cell)。
[0005]诱导多功能干细胞首先是由日本科学家Yamanaka利用小鼠成纤维细胞诱导出来的(Takahashi，K.and S.Yamanaka, Induct1n of pluripotent stem cells frommouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell, 2006.126(4): p.663-76.)，通过过表达0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种转录因子使细胞从终末分化状态变为干细胞状态。后来又成功利用人成纤维细胞实现了向干细胞的诱导。iPS细胞在形态、表观遗传、功能等方面与ES细胞相似，但却避免了 ES细胞所要面临的伦理学问题。
[0006]自从iPS技术问世后，其成为一个全球的研究热点。全世界许多实验室都在逐步利用不同病人来源的体细胞重编程出相应的iPS细胞，这类细胞不仅具有相应疾病的特征性改变，并且对疾病模型的建立、研究以及药物筛选等方面具有重要意义。目前已经成功建立iPS细胞系的疾病包括高雪氏症、帕金森病、21三体综合征(Park，1.H.，et al.，Disease-specific induced pluripotent stem cells.Cell, 2008.134(5): p.877-86.)、扩张型心肌病(Sun, N., et al., Patient-specific induced pluripotent stemcells as a model for familial dilated card1myopathy.Sci Transl Medj 2012.4(130): p.130ra47.)、色素性视网膜炎(Jin，Z.B., et al., Modeling RetinalDegenerat1n Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells.Plos One,2011.6(2).)、多发性神经纤维瘤(Larribere，L., et al., NFl loss inducessenescence during human melanocyte differentiat1n in an iPSC—based model.Pigment Cell Melanoma Res , 2015.)、白血病(Kurokawa，M.and M.Miyauchi ,[Induced pluripotent stem cells from leukemia patients as a platform fordissecting pathogenesis].Rinsho Ketsueki，2014.55(10): p.2202-7.)、类风湿性关节炎(Lee, J., et al., Generat1n of disease-specific induced pluripotentstem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.Arthritis Research & Therapy, 2014.16(1).)等，在皮肤病相关疾病中利用病人体细胞重编程出病人iPS细胞的实例较少。
[0007]由于iPS细胞可以来源于多种成体细胞，病人的iPS细胞成为一个研究热点。利用病人的成体细胞诱导出的iPS细胞具有此类疾病的特点，所以病人iPS细胞在疾病治疗、疾病模型建立以及药物筛选等方面具有重要的意义。通过基因修饰等手段使病人iPS细胞不具有疾病特征，从而诱导分化出相关的细胞、组织或者器官，进行病人自体移植治疗，不会发生免疫排斥反应，这是iPS细胞与ES细胞相比较的另一个优势。目前已有多种病人的体细胞呗诱导为多功能细胞，而利用白癜风病人的体细胞诱导为多功能干细胞未见文献报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法。
[0009]本发明首次提供用白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤:白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取；白癜风病人多功能干细胞的诱导;获得的白癜风病人诱导多功能干细胞的鉴定。
[0010](I)白癜风病人皮损处成纤维细胞的获取:
A.取得白癜风病人皮损组织后，在超净台取出，用含1%双抗(青霉素和链霉素)PBS缓冲液洗涤3次，剪碎成Imm3小块。
[0011]B.灭菌后的盖玻片盖于组织块上，加含10%血清的高糖DMEM培养基(Hycl0ne)37度培养，10至15天可见成纤维细胞出现，2至3天换液。
[0012](2)白癜风病人多功能干细胞的诱导:
A.步骤(I)所得的白癜风病人皮损处成纤维细胞取15细胞量，再加入0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种逆转录病毒感染，病毒量分别为400仙，过表达0ct4、Sox2、Klf4、c_Myc四种转录因子。
[0013]B.细胞培养24h后转移到饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)上，更换诱导培养基，培养条件为37°C、5%C02、5%θ2，每天换液，显微镜观察细胞形态拍照，12天后挑单克隆至新的饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)上。
[0014]其中诱导培养基成分为ES培养基加维生素C(50mg/ml)，ES培养基包括80% DMEM/F12、20% KSR、1% Non-essential amino acids、lmM L-gIutaMAX > 0.1mM β-mercaptoethanol、5ng/ml bFGFo
[0015]C.用ES培养基培养，置于低氧培养箱内，条件为37°C、5%C02、5%02，每天更换培养基，显微镜观察细胞形态并拍照。
[0016](3)鉴定白癜风病人诱导多功能干细胞的特征，确定其具有干细胞的特点以及功會K。
[0017]本发明的技术优点
(I)iPS细胞是与ES细胞及其相似的一类诱导多功能干细胞，在表观遗传、功能等方面均有很高的相似性，而ES细胞自问世以来却具有争议，因为人的ES细胞来源于流产胎儿，不符合伦理学，并且不适合批量生产，对于其应用产生了阻碍，但是iPS细胞在来源方面不具备这样的问题，已经有多种细胞建立了 iPS细胞系，包括成纤维细胞、淋巴细胞、肝脏细胞、角质细胞，甚至尿液细胞等；
(2)iPS细胞不仅来源广泛，也可以在利用其过程中避免免疫排斥反应，因为人ES细胞毕竟还是同种异体细胞，利用ES细胞来治疗疾病的话存在免疫排斥问题，而病人自体的iPS细胞在治疗过程中则不会产生免疫排斥反应。
[0018](3)来自于病人的iPS细胞证实了具有相应疾病的特征，通过对病人iPS的研究就可以清楚了解到疾病在某基因方面的缺陷等，有利于疾病的研究。同时也可以利用病人iPS细胞建立相应的疾病模型，将其输入至小鼠体内，建立出人源化小鼠疾病模型，可以进行药物筛选等方面的研究。
[0019](4)病人iPS细胞系的建立成为一个热点，许多实验室已经建立了多种疾病的iPS细胞系，比如高雪氏症、帕金森病、21三体综合征、扩张型心肌病、色素性视网膜炎、多发性神经纤维瘤、白血病、类风湿性关节炎等。在皮肤病学的研究中，也可以利用这项技术来研究相关疾病，但是目前来说实例并不多，并且在色素脱失方面疾病的研究更是稀少。本发明首次利用白癜风病人皮损处的成纤维细胞诱导出多功能干细胞，对以后白癜风的干细胞治疗以及白癜风发病机制的研究具有重要意义。
【附图说明】
[0020]图1.白癜风病人皮损处成纤维细胞形态观察图，图中标尺大小为ΙΟΟμπι;
图2.白癜风病人皮损处成纤维细胞诱导为多功能干细胞过程中第4天细胞形态学观察Γ4)，箭头处表示出现的iPS小克隆;2幅图中标尺大小均为ΙΟΟμπι;
图3.第二代白癜风病人iPS(VP-1PS)细胞形态学观察图；a: x4;b:xl0;图a和b中标尺大小均为ΙΟΟμπι;
图4.VP-1PS细胞碱性磷酸酶染色结果;a: x4; b: XlO;图a和b中标尺大小为ΙΟΟμπι;
图5.VP-1PS细胞免疫荧光染色检测干细胞表面标记物的表达结果;标记物包括0CT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4;
图6.VP-1PS细胞在干细胞相关基因的相对表达图(*:P<