促进真皮乳头细胞生长的组合物及其医药组合与制备方法
【技术领域】
[0001]本发明关于一种用于促进真皮乳头细胞(dermal papilla cell)生长的组合物的制备方法，尤指一种由脐带组织的类纤维母细胞经培养而获得含有特定组份的组合物的制备方法；本发明亦关于一种促进真皮乳头细胞生长的组合物，其具有促进真皮乳头细胞增生的效果。本发明亦关于一种包含有效剂量的前述组合物的医药组合，以达到促进真皮乳头细胞生长的效果。
【背景技术】
[0002]现有技术中，藉由培养上皮细胞和间质干细胞等方式获得干细胞因子(stem cellfactor, SCF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)和类膜岛素生长因子(insulin-like growthfactor, IGF)等生长因子，其缺点在于一般冷冻需渐进降温，较为耗时，且在后续培养过程中，培养基所含的盐类会造成对皮肤毛发的刺激性。
【发明内容】
[0003]鉴于现有技术未使用冻融循环方式而导致产量较低、且无同时进行浓缩与去盐类步骤以及整体步骤较为繁复耗时等缺点，本发明的目的在于提供一种促进真皮乳头细胞(dermal papilla cell)生长的组合物的制备方法，该方法通过液态氮冷冻解冻循环方式破坏细胞并收集细胞裂解液(cell lysate)，以获得更多的多肽混合物(polypeptide orprotein cocktail)，并经由浓缩去盐以获得特定分子量的组合物。
[0004]为达上述目的，本发明提供一种促进真皮乳头细胞生长的组合物的制备方法，其包含:提供猪脐带(umbilical cords)组织；以冲洗液冲洗该猪脐带组织，使血球细胞和体液从猪脐带组织中移除；由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素；将细胞及细胞激素进行冻融循环至少2次，以获得多肽混合物；以及将该多肽混合物浓缩去盐，以获得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿(dalton，Da)。
[0005]依据本发明，“冲洗液”如此处所述指对于猪脐带组织为等张的溶液；优选的所述冲洗液为90%氯化钠溶液或磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solut1n，PBS)。
[0006]依据本发明，“分离细胞”如此处所述指将猪脐带切成非常小的碎片以形成脐带碎片，并将4块至6块脐带碎片放置于培养皿中，其培养皿中包括10毫升(ml)的生长培养基(含有a -MEM以及10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS))，置于恒温容器培养10天后去除脐带碎片，且每周加两次3ml培养基，其中恒温容器指二氧化碳(CO2)培养箱(含有5% CO2)，以获得细胞。
[0007]依据本发明，“继代培养”如此处所述指当细胞生长至高密度时，即进行收集细胞，并经稀释后分殖至新的培养皿中，以降低细胞密度并维持细胞生长，其稀释比例依细胞种类而异。
[0008]依据本发明，“冻融循环”如此处所述指将细胞及其细胞激素放置于液态氮中冷冻，然后再将细胞取出至室温中融化，反复多次而达到破坏细胞膜的效果。如本案所例示，将含有细胞的冷冻管直接浸置于液态氮中，再将含有细胞的冷冻管由液态氮中取出置于37°C水浴解冻，重复以上步骤循环至少2次，并将破裂的细胞于100G离心15分钟至20分钟。
[0009]依据本发明，“浓缩去盐”如此处所述指将多肽混合物放置于过滤装置中，并经由离心及去除上清液，使多肽混合物达到浓缩并去除盐类的效果。如本案所例示，将多肽混合物置于超滤装置或离心设备，以减少多肽混合物的体积、增加浓度以及去除杂质(如盐类)，从而获得组合物，其中该组合物的分子量大于3000道尔顿(dalton，Da)。
[0010]优选的，所述组合物包含一种或多种选自于由血管生成素(ang1genin)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，I3DGF)、纤维母细胞生长因子7 (fibroblast growth factor7，FGF7)及其组合所组成的组。
[0011]优选的，在所述的由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3天至18天，以获得细胞激素。
[0012]优选的，在所述的由猪脐带组织分离细胞并进行继代培养以获得细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养6天，以获得细胞激素。
[0013]依据本发明，“猪脐带组织”如此处所述指来自无特定病原(specific pathogenfree, SPF)猪。
[0014]本发明又提供一种以前述制备方法所获得的组合物，该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果。
[0015]依据本发明，“促进真皮乳头细胞生长”如此处所述指该组合物使真皮乳头细胞相较于初始未实验或本案所例示的控制组的生长速率成长5%至50%。
[0016]本发明再提供一种医药组合，其包含有效剂量的前述组合物以及其医药可接受的溶剂及/或赋形剂。
[0017]优选的，所述的有效剂量的组合物为每毫升0.05纳克(ng/ml)至20ng/ml。
[0018]依据本发明，“医药可接受的溶剂及/或赋形剂”如此处所述指任意可做为人类或动物内服或外用的溶剂，例如酒精-水共溶剂、水、生理食盐水；更佳的，所述的医药可接受的溶剂及/或赋形剂是水或生理食盐水；其中溶剂加入的量，以能维持组合物的有效剂量为原则。
[0019]本发明所述的制备方法藉由不含血清的培养基培养细胞特定天数以获得细胞激素，并经由重复冻融以破坏细胞，以获得更多的多肽混合物，再以浓缩去盐以获得特定分子量的组合物，其中该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果，且相较于初始未实验的真皮乳头细胞的生长速率成长5 %至50 %。
【附图说明】
[0020]图1A为本发明的组合物施于受体额头及发线交界部位并用于促进真皮乳头细胞增生的实验第O天的图片。
[0021]图1B为本发明的组合物施于受体额头及发线交界部位并用于促进真皮乳头细胞增生的实验约2个月后(即第60天)的图片。
【具体实施方式】
[0022]本发明将由下列的实施例做为进一步说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。本领域技术人员可以做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。
[0023]制备例I由猪脐带分离细胞
[0024]提供猪脐带，将猪脐带以75%乙醇清洗20秒至30秒后，再以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗，随后将脐带切成3至4等份并置于已灭菌的培养盘中。以手术刀或镊子沿脐带静脉将脐带打开，并将脐带以两镊子将脐带拉开，小心将动脉移除以避免任何血液泼溅至华通氏胶(Wharton’s jelly,即脐带内的胶状结缔组织)，同时将静脉一并移除。将华通氏胶块