从线羊膜(cord amn1n)移除并置于新鲜且含有a -MEM的培养皿中以保持其润湿。接着以外科剪刀将脐带切成非常小的碎片以形成脐带碎片，并将4-6块脐带碎片放置于培养盘中，其培养盘中包括10毫升(ml)的生长培养基(含有a -MEM以及10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS))，并置于CO2培养箱(含有5% CO 2)。每周加两次3ml培养基。10天后将脐带碎片移除，并以PBS洗涤后加入新鲜的培养基，使细胞培养至80%至90%满，并进行继代培养以增殖细胞。
[0025]制备例2继代培养细胞
[0026]藉由真空抽吸器吸除培养基，并以5ml PBS清洗培养盘中的细胞。再次移除PBS，并将3ml且浓度为0.25%的胰蛋白酶(trypsin)-EDTA加到各培养盘中；将培养盘放置在37°C、5分钟，将分离的细胞收集于15ml离心管中，以400G离心5分钟，去除上清液并加入2ml培养基。藉由吸量管将细胞重新悬浮，并吸取10 μ I细胞与10 μ I刚果蓝(trypan blue)混合，且以自动细胞计数器进行细胞计数。
[0027]制备例3制备细胞激素(cytokines)
[0028]为产生细胞激素，首先将制备例2所得的细胞接种到细胞培养皿中，且每培养皿生长至3x 15至7x 10 5个细胞的密度。将细胞培养在37°C的CO 2培养箱中，培养基每周更换两次(约每3天至4天)，直到细胞生长至90%满。
[0029]当细胞生长至90%满时，以5ml PBS洗涤细胞2次，再将8ml不含血清的培养基加到每个培养皿中，并于37°C的CO2培养箱中培养6天，以获得细胞激素。
[0030]制备例4收集多肽混合物
[0031]—些细胞因子会释放至培养基中，而另一些细胞因子则驻留在细胞内。收集培养基，并将附着的细胞暴露于3ml且浓度为0.2%的胰蛋白酶-EDTA，在37°C处理5分钟，收集细胞并以40G离心5分钟并去除上清液，再以1ml的PBS洗涤已离心沉淀的细胞I次。再次离心并去除上清液，然后将细胞重新悬浮在3ml PBS并置于冷冻管中，再将含有细胞的冷冻管直接浸置于液态氮中。将含有细胞的冷冻管置于37°C水浴解冻，重复以上冻融循环2次以打破细胞。将破裂的细胞于1000G离心15分钟至20分钟。混合收集的上清液和细胞裂解物以获得多肽混合溶液及其总产率，并藉由酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)检测上清液或含有多肽混合溶液(例如bFGF或F1DGF等)的浓度。
[0032]制备例5多肽混合物的浓度及去盐(desalting)
[0033]含有多肽的混合溶液需经浓缩以获得特定浓度的多肽。将制备例4所获得的上清液及细胞裂解物放入超滤装置(型号为Amicon Stir Cell)或离心设备(Amicon FilterCentrifugat1n Device)以减少含有多肽的混合溶液的体积以及增加浓度，以获得经浓缩的多肽混合溶液。经浓缩的多肽混合溶液由超滤装置或离心设备放入收集管中。取2ml经浓缩的多肽混合溶液以评估多肽混合溶液的浓度。
[0034]制备例6冷冻干燥(Iyophilizat1n)多肽混合溶液
[0035]将制备例5所获得的50ml经浓缩的多肽混合溶液置于夹链袋并于_80°C过夜(12小时至16小时)。将含有经浓缩的多肽混合溶液的袋子一同放入冷冻干燥机，冷冻干燥多肽混合溶液(4天至5天)，以获得冻干的多肽混合粉末。将冻干的多肽混合粉末以无菌水再悬浮，以获得多肽溶液，并将多肽溶液以0.22 μ m过滤膜过滤以获得组合物，并将该组合物储存于-80°C，其中该组合物包含有55ng/ml血管生成素(ang1genin)、6ng/ml血小板衍生生长因子O3DGF)以及4ng/ml纤维母细胞生长因子7 (FGF7)。
[0036]实施例1毛发增生实验
[0037]以飞针在欲施用部位制造微创伤口(深度约为0.2毫米(mm)至2.5mm)，再于该部位涂抹制备例6所获得的组合物，每次使用1ml，共使用7次，且施予频率为I周至2周使用I次。结果如图1A所示，将制备例6所获得的组合物施予受体额头与发线交界部位，如图1B所示，由于真皮乳头细胞可形成毛囊且为毛发生长的主要细胞之一，故施用本发明所述的组合物约2个月后，可藉由促进真皮乳头细胞生长而生长出新的毛发，且新的毛发也变较粗。
【主权项】
1.一种促进真皮乳头细胞生长的组合物的制备方法，其包含: 猪脐带组织； 以冲洗液冲洗该猪脐带组织，使血球细胞及体液从该猪脐带组织中移除； 由该猪脐带组织分离细胞并进行继代培养，以获得细胞激素； 将该细胞及该细胞激素进行冻融循环至少2次，以获得多肽混合物；以及 将该多肽混合物浓缩去盐，以获得该组合物。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该组合物的分子量大于3000道尔顿。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将该多肽混合物浓缩去盐的步骤中，所获得的组合物包含一种或多种选自由血管生成素、血小板衍生生长因子、纤维母细胞生长因子7及其组合所组成的组。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在由该猪脐带组织分离该细胞并进行继代培养以获得该细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养3天至18天，以获得该细胞激素。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在由该猪脐带组织分离该细胞并进行继代培养以获得该细胞激素的步骤中，将分离所得的细胞置于不含血清的培养基培养6天，以获得细胞激素。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，该猪脐带组织来自无特定病原猪。7.一种如权利要求1至6任一项所述的制备方法所获得的组合物，其特征在于，该组合物具有促进真皮乳头细胞增生的效果。8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，该组合物使真皮乳头细胞的生长速率增加5%至50%。9.一种用于促进真皮乳头细胞生长的医药组合，其包含如权利要求7或8所述的有效剂量的组合物以及其医药可接受的溶剂及/或赋形剂。10.如权利要求9所述的医药组合，其特征在于，该组合物的有效剂量为每毫升0.05纳克(ng/ml)至 20ng/ml。
【专利摘要】本发明提供一种促进真皮乳头细胞(dermal？papilla？cell)生长的组合物，该组合物是通过不含血清的培养基培养细胞特定天数以获得细胞激素，并经由多次冻融循环来破坏细胞以获得更多的多肽混合物，再浓缩去盐以获得特定分子量的组合物，其中该组合物具有促进真皮乳头细胞生长的效果，且相较于初始未实验的真皮乳头细胞可促进生长速率约5％至50％。
【IPC分类】A61P17/14, A61K38/00, A61K38/22, C12N5/071
【公开号】CN105505851
【申请号】CN201510663170
【发明人】蔡政宪, 席宇廷
【申请人】讯联生物科技股份有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年10月14日