QIDNO. 3);利用引 物P3(SEQIDNO. 13)和P4(SEQIDNO. 14)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域 (SEQIDNO. 4);利用引物P5(SEQIDNO. 15)和P6(SEQIDNO. 16)进行PCR扩增获得CD3ζ基 因的胞内信号结构域（SEQIDNO. 5)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与Mlul/Sall 双酶切后的慢病毒表达载体pWPT-GFP连接。
[0031] 步骤（2)中，对于合成编码大鼠生长激素信号肤和肥RlScFv的核巧酸序列的方法 没有特别的限定，可W为本领域常用的各种方法，例如可W通过全基因合成技术合成。
[0032] 具体地，得到序列正确的pWPT-HERlScFv-CD8-CD 137-CD3 ζ的方法可W包括： 通过全基因合成技术合成编码大鼠生长激素信号肤和肥RlScFv融合基因的核巧酸序列 (沈QID NO. 8)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-肥RlScFv ;然后将pGSI-肥RlScFv进行 EcoR V /Mlul双酶切，与经限制性内切酶BamHI单酶切，用Klenow化agment酶平头，再用 Mlul单酶切后的步骤（1)得到的重组质粒ρΚΡΤ-〔08-〔0137-〔03ζ连接，经测序鉴定，得到 序列正确的pWPT-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。其中，大鼠生长激素信号肤的核巧酸序列如 沈QID NO. 6所示，肥RlScFv核巧酸序列如沈QID NO. 7所示。
[0033] 本发明还提供了一种工程化肥R1祀向性的NKT细胞，所述NKT细胞是由上述嵌合 抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞（即CAR肥R1-NKT细胞）。
[0034] 对于工程化肥R1祀向性的NKT细胞的制备方法没有特别的限定，可 W为本领域技术人员能够想到的任何方法，优选情况下，该方法包括：包装携带 pWPT-肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ编码基因的慢病毒；利用得到的慢病毒感染NKT细胞，使 ΝΚΤ细胞表达嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。
[0035] 对于包装携带ρΚΡΤ-ΗΕΚ15οΡν-〔08-〔0137-〔03ζ编码基因的慢病毒的方法没 有特别的限定，可W为本领域技术人员常用的各种方法，优选情况下，将慢病毒表达载体 pWPT-肥Κ15ΕΡν-〔08-〔0137-〔03ζ与辅助质粒（如psPAX2、pMD2.G)共转染 293Τ包装细胞， 转染48-7化时收集病毒上清，离必、过滤，在滤液中添加5XPEG6000-NaCl进行混匀，离必 后弃上清，沉淀用0-4°C预冷的无菌PBS溶解，获得病毒浓缩液。
[0036] 对于慢病毒感染NKT细胞的方法没有特别限定，可W为本领域常用的各种方法， 优选情况下，该方法包括：取1X1〇7-5X107个NKT细胞，弃掉旧的培养液，加入2-4血新鲜 GT-巧51培养液，再加入200-400μL病毒浓缩液、2-4μL1X10 6mg/mL鱼精蛋白和终浓度为 800-1200U/mL的IL-2,置于30-37°C、饱和湿度为3-6%的(?培养箱中感染12-1化后，弃 培养液，将细胞转至未包被的培养瓶中，加入20-50mL的GT-T551培养基，再加入终浓度为 800-120011/1^的比-2，于30-371：、饱和湿度为3-6%的〇)2培养箱中培养12-1化，获得嵌 合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞。
[0037] 进一步优选地，慢病毒感染ΝΚΤ细胞的方法还包括；将上述培养后获得的慢病毒 感染的ΝΚΤ细胞用IL-2的终浓度为800-1200U/mL的GT-T551培养液进行体外诱导，待 细胞的密度为80-90%时将细胞转入细胞培养袋中，隔1. 5-2. 5天加入IL-2的终浓度为 800-1200U/mL的新鲜GT-T551培养液进行扩增培养并将细胞扩增至总量为1X1〇9-2X1〇9 个细胞。
[0038] 嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞表达的嵌合抗原受体 的成熟蛋白氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗 原受体前体蛋白由信号肤、肥RlScFv、CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域 和〔03ζ的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肤后 成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于ΝΚΤ细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体 的成熟蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQIDNO. 2所示。该嵌合抗原受体W基因 CD8的hinge区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导 结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO. 9所示，对应的基因编码序列如SEQIDNO. 10所示。
[0039] 本发明还提供了上述方法制备得到的工程化肥R1祀向性的NKT细胞。
[0040] 本发明还提供了工程化肥R1祀向性的NKT细胞在制备用于治疗肿瘤的制剂中的 应用。优选情况下，肿瘤是指进展期肥R1阳性肺癌，尤其为复发难治的进展期肥R1阳性肺 癌。
[00川实施例
[0042]W下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0043]W下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所 用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：
[0044]NKT细胞培养基GT-T551购自TaKaRa公司。
[0045] 淋己细胞分离液购自T抓公司。
[0046]CD3单克隆抗体、重组纤维连接蛋白（retronectin)均购自TaKaRa公司。
[0047] 重组人蛋白干扰素-Y、重组人白介素2购自protech公司。
[004引 总RNA提取试剂盒RNAisoReagent、高保真DNA聚合酶（PrimeSTARK服DNA Polymerase)、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。
[0049]Reve;rtAid?FirstStrandcDNASynthesisKit购自F'ermentas公司。
[0050] BglII、EcoRI、Mlul、BamHI、Sal I、EcoRV购自F'ermentas公司。
[0051]修饰酶KlenowRra卵ent购自F'ermentas公司。
[0052] 琼脂糖凝胶DM回收试剂盒、普通DM产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天 根生化科技有限公司。
[0053] pWPT-GFP、PSPAX2、pMD2. G均购自Addgene公司。
[0054] pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。
[00巧]Transl-Tl Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公 司。
[0056] LipofectamineTM 2000Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。
[0057] 293T包装细胞购自美国ATCC。
[0058] 阳G6000-NaCl中阳G6000终浓度为25. 5质量％，化C1终浓度为1. 2M，PEG6000和 化C1均购自上海索莱宝生物科技有限公司。
[0059] 胎牛血清购自德国PAA公司。
[0060] 高表达肥R1的人肺腺癌细胞A549购自美国ATCC。
[006。CellCountingKit-8 (CCK8)试剂盒购自北京沃比森科技有限公司。
[0062] 所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
[006引实施例1NKT细胞的制备
[0064] (1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋己细胞分离液，通过密度梯度离必方 法分离获得单个核细胞（PBMCs)。
[0065] (2)PBMCs洗Η...