一种抗hpv16l1蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及免疫学领域，更具体地，本发明设及一种特异性结合人乳头瘤病毒 HPV16L1蛋白的抗体、制备方法及其在体外检测试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002] 人乳头瘤病毒（HPV)是一组无包膜的小DNA病毒，感染人皮肤及粘膜上皮组织， 可诱发产生痛状增生乃至引发良恶性肿瘤。根据感染后诱发病变的良恶性不同分为高危 型HPV和低危型HPV。高危型HPV感染与宫颈癌及癌前病变的发生密切相关，此外还与粘 膜相关的癌及癌前病变的发生相关。HPV16属于高危型HPV，流行病学调查及临床统计数 据均显示HPV16与宫颈癌及其他癌症呈现高度相关，HPV16和HPV18型诱发的宫颈癌占所 有HPV阳性宫颈癌的70%W上，高危型HPV感染相关的恶性病变中W妇女宫颈癌的发病率 最高，全球范围内的发病率仅次于乳腺癌，高居妇科恶性肿瘤的第二位。预防HPV感染和宫 颈癌最有效的方法就是接种HPV疫苗，目前已上市的HPV疫苗，包括Merck公司的四价疫苗 "Gardasir郝九价疫苗"Gardasil9"，W及GSK公司的双价疫苗"Cervarix"，运Ξ种疫苗都 包括HPV16的疫苗成分。HPV疫苗可刺激机体产生保护性中和抗体，在有效的治疗和预防 HPV感染和宫颈癌中具有重要意义。
[0003] 研究发现，具有中和能力的单抗基本都识别构象表位，并且大多数识别型特异性 构象表位的单克隆抗体都具有中和能力。不同中和单抗通过封闭病毒与细胞第二受体的结 合位点，可阻止病毒感染入胞的发生，对运些单抗结合表位的研究有利于解释病毒感染入 胞的关键位点。目前多数认为，在动物的HPV感染中，血清IgG(主要是中和IgG)能W足够 高的浓度穿过宫颈上皮，特别是在鱗状、柱状上皮结合处，从而与病毒颗粒结合并阻止感染 发生。对疫苗诱发产生的中和抗体活性的测定是检测预防性疫苗免疫保护性的重要标准。 中和活性抗体在HPV疫苗的免疫原性检测和含量测定中具有重要的应用前景。目前仅有 一种HPV16中和单抗一一化6.V5抗体在国外有所报道，该抗体成功的应用于HPV16疫苗生 产过程中的有效成分的质量控制。
[0004] 因此，研发更多类型，针对各种不同表位的HPV16单抗，对于更好的研究HPV病毒 W及研发HPV疫苗具有重要作用，并将抗体应用于HPV感染的诊断、预防和治疗也是十分必 要。
【发明内容】
[0005] 为了解决W上技术问题，本发明的一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒 HPV16L1蛋白和/或VLP的抗体，包含有SEQIDNO. 1-3所示的重链可变区的CDRUCDR2和 CDR3区域和SEQIDNO. 4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
[0006] 本发明的另一个方面是提供一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV16L1蛋白和/或 VLP的抗体，包含有如SEQIDNO. 7所示的重链可变区氨基酸序列和如SEQIDNO. 8所示的 轻链可变区氨基酸序列。
[0007] 本发明所述抗体均为单克隆抗体。
[0008] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是由保藏编号为CGMCC NO. 10955的细胞产生的单克隆抗体。所述细胞是由免疫后的宿主脾细胞和骨髓瘤细胞融合 得到的杂交瘤细胞，其被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)， 保藏编号为CGMCCNO. 10955,保藏日期为2015年7月6日。
[0009] 本发明中所述抗体为型别特异性抗体，仅能特异性的结合HPV16L1蛋白和/或 VLP，而对其他大部分的HPV型别均无反应，如HPV6、11、16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 59、68等型别。
[0010] 在本发明中，所述抗体具有中和活性，可阻断HPV16型假病毒感染293FT细胞，具 有中和假病毒的作用。
[0011] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述抗体是单价或二价抗体。
[0012] 在本发明中，可W采用Kohler等在化化re256:495(1975)中报道的杂交瘤制备 方法来制备所述单克隆抗体。首先用免疫原（必要时候添加佐剂）免疫注射小鼠或其它合 适的宿主动物。在本发明中，所述免疫原是汉逊酵母细胞表达产生的HPV16L1蛋白和/或 该HPV16L1蛋白在体外自动组装形成的病毒样颗粒（VLP)。其抗原的氨基酸序列如SEQID NO. 11所示。
[0013] 免疫原或佐剂的注射方式通常为皮下多点注射或腹腔注射。佐剂可W利用弗氏佐 剂（弗氏完全性佐剂或者弗氏不完全性佐剂）或MPkTDM等。动物在接受免疫后，体内会产 生分泌特异性结合免疫原的抗体的淋己细胞。收集目的淋己细胞，并用合适的融合剂（如 阳G4000)将其与骨髓瘤细胞融合，从而获得杂交瘤细胞（Goding，MonoclonalAntibodies: PrinciplesandPractice，pp. 59-103,AcademicPress，1996)。
[0014] 将上述制备的杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基中含有一 种或多种能够抑制未融合的、母体骨髓瘤细胞生长的物质。例如，对于缺乏次黄嚷岭鸟嚷岭 憐酸转移酶（HGPRT或HPRT)的母体骨髓瘤细胞，在培养基中添加次黄嚷岭、氨基噪岭和胸 腺喀晚（HAT培养基）等物质将可W抑制HGPRT-缺陷细胞的生长。
[0015] 优选的骨髓瘤细胞应该具有融合率高，抗体分泌能力稳定，对HAT培养基敏感 等能力。其中，骨髓瘤细胞首选鼠源骨髓瘤，如M0P-21和MC-11小鼠肿瘤衍生株灯肥 SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,Calif.USA),W及SP-2/O或 X63-A妍-653 细胞株（AmericanTypeCyltureCollection,Rockville,Md.USA)。另 夕F，还可W利用人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞株制备人单抗化ozbor，J.Immunol.， 133:3001(1984)；Brodeuretal. ，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesand Applications，pp. 51-63,MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。
[0016] 杂交瘤细胞生长的培养基用于检测针对特异抗原的单抗的产生。可W使用 下列方法来测定杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性：免疫沉淀或体外结合试验， 如放射免疫试验巧IA)、酶联免疫吸附试验巧LISA)。例如，利用Munson等在Anal. Biochem. 107:220(1980)中描述的Scatchard分析法可测定单抗的亲和力。
[0017] 在确定杂交瘤产生的抗体的特异性、亲和力和反应性之后，目的细胞株可W通过 Coding,MonoclonalAntibodies：PrinciplesandPractice，pp. 59-103,AcademicPress， 1996描述的有限稀释法进行亚克隆化。合适的培养基可W是DMEM或RPMI-1640等。另 夕F，杂交瘤细胞还可W腹水瘤的形式在动物体内生长。
[0018] 利用传统的免疫球蛋白纯化方法，如蛋白A琼脂糖凝胶、径基憐灰石层析、凝胶电 泳、透析或亲和层析等，可W将亚克隆细胞分泌的单抗从细胞培养液、腹水或血清中分离出 来，进而得到所述单克隆抗体。
[0019] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述得到的单克隆抗体为4A3。
[0020] 本发明的另一个方面是提供了一种特异性结合人乳头瘤病毒HPV16L1蛋白和/或 VLP的抗原结合部分，包含有SEQIDNO. 1-3所示的重链可变区的CDRUCDR2和CDR3区域 和SEQIDNO. 4-6所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域；
[0021] 其中，所述抗原结合部分选自F油、F油'、F(油'）2、FtdAb、互补决定区片段、单链 抗体，人源化抗体、嵌合抗体或双抗体。
[0022] 所述特异性结合HPV16L1蛋白和/或VLP的抗原结合部分可使用本领域技术人员 公知的方法获得，如利用化学试剂处理的方法，或利用蛋白酶消化的方法，如木瓜蛋白酶、 胃蛋白酶等。
[0023] 本发明的另一个方面是提供了一种保藏编号为CGMCCNO. 10958的杂交瘤细胞，其 被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（CGMCC)。
[0024] 本发明的另一个方面是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明的特异性结合 人乳头瘤病毒HPV16L1蛋白和/或VLP的抗体或其抗原结合部分。
[0025] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述试剂盒中还包含与HPV16L1蛋白和/ 或VLP特异性结合的第二抗体。 阳〇%] 更优选地，所述第二抗体是由保藏编号为CGMCCNO. 10958的细胞产生的单克隆抗 体，保藏日期为2015年7月6日。
[0027] 更优选地，所述第二抗体为甜8。
[0028] 作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第二抗体采用与本发明所述特异性 结合人乳头瘤病毒HPV16的抗体相同的方法制备。
[0029] 本发明还提供了上述试剂盒在检测样品中HPV16的L1蛋白和/或VLP的存在或 者水平中的用途。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 本发明提供的特异性结合人乳头瘤病毒HPV16L1蛋白和/或VLP的抗体或抗原结 合部分与大部分的HPV其他亚型，如HPV6、11、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等 型别无交叉反应，特异性高，具有中和HPV16假病毒并阻断其感染的特性，且亲和性高。可 用于样品中检测HPV16L1蛋白和/或VLP的存在或水平试剂盒的研发，W及针对患者的治 疗和对易感人群进行被动免疫，具有良好的应用前景。
[0032] 生物保藏信息：
[0033] 保藏编号：CGMCCNO. 10955
[0034] 保藏日期：保