一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，适于预防和治疗幽门螺杆菌感染引起的急慢性胃炎、消化性溃疡等胃部疾病，具体为一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)与急慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃MALT淋巴瘤等胃部疾病的发生密切相关。1994年世界卫生组织将其列为一类致癌因子。目前发达国家幽门螺杆菌感染率达到30%，发展中国家人群的Hp的感染率高达50%以上。根除HP后不仅能加速胃溃疡愈合，而且能显著降低胃炎复发率。但目前要彻底根除HP仍然很困难，还没有一种单一的抗生素对HP感染的治疗有效，必须采用多种抗生素联合治疗，如奥美拉唑、甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和铋制剂等联合使用。但联合抗生素越多，副作用越大，抗药性也变得更加复杂、病人治疗费用高、依从性差、副反应多，Hp耐药性显著增强，停药后易复发。Hp疫苗是被认为是预防人群Hp感染的最有前景的方法之一，但由于Hp感染在胃粘膜，常规疫苗免疫产生的体液免疫和细胞免疫难以达到该领域，其保护作用有限，也是迄今为止幽门螺杆菌及亚单位疫苗预防治疗幽门螺杆菌致胃病难的主要原因，到目前为止并未有真正意义上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于预防，然而针对已感染人群或病人的治疗是否有作用，目前没有相关的研究报道。
[0003]脲酶分布于Hp表面，广泛表达且高度保守，较大的相对分子质量和颗粒状结构也有利于刺激机体产生免疫反应，可作为Hp疫苗的候选抗原。Hp脲酶由A、B两个亚单位组成，呈六聚体。其中B亚单位相对分子质量约64000，抗原性强，且能使机体产生更有效的保护作用。本专利采用基因突变优化改造了 Hp脲酶B亚单位(Urease B subunit, UreB)DNA序列，并构建到原核表达载体，实现其在大肠杆菌中的高效可溶性表达，避免了无活性包涵体的形成。卵黄免疫球蛋白(IgY)由于其来源便宜，产量高，成本低，容易制备，具有热稳定性、耐酸和耐蛋白酶等特点以及动物种系发生学距离的优势，而被作为口服食品，预防和控制肠道、口腔细菌的感染，这些研究与应用为制备抗Hp的特，异性IgY抗体提供了可能，并为预防和治疗Hp感染的胃病开辟了一条新路径。
[0004]通过现有的文献检索发现，如陈喆等发表题为《幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定》(《浙江大学学报:医学版》，2003，第1期(1):4-8)。从文中可知，脲酶原核表达多出现包涵体表达，而包涵体表达常导致蛋白变性失去原有天然结构，且蛋白复性耗时长且技术较复杂，明显增加了蛋白表达纯化成本。刘晓峰等题为《表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒鼠伤寒杆菌口服疫苗的制备》(《中华消化杂志》，2001, 09期(9): 522-525)，对脲酶B亚单位的原核表达和疫苗研究，但由于Hp感染在胃粘膜，常规疫苗免疫产生的体液免疫和细胞免疫难以达到该领域，其保护作用有限，也是迄今为止幽门螺杆菌及亚单位疫苗预防治疗幽门螺杆菌致胃病难的主要原因，到目前为止并未有真正意义上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于预防，然而针对已感染人群或病人的治疗是否有作用，目前没有相关的研究报道。
[0005]经对现有的专利技术检索发现，玉义胜等人在《对幽门螺杆菌定居具有抑制活性的糖蛋白》一文中，从牛奶和鸡蛋中筛选出特异地结合幽门螺杆菌脲酶的糖蛋白，抑制菌的定生，但经过分析发现这种糖蛋白在原料中含量低，制备的糖蛋白产量低、成本高。迈耶等人在《幽门螺杆菌活疫苗》中将幽门螺杆菌脲酶基因插入减毒沙门氏菌细胞，制成疫苗，虽然可以产生免疫反应，但减毒沙门氏菌存在反毒和丢失脲酶基因的风险。根据美国食品与药物管理机构(FDA)的规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，在人和动物体内也无法以抗生素来维持重组质粒的稳定性免疫应答反应。聂作明等人用将用超声波粉碎幽门的幽门螺杆菌抗原和HP尿素脲酶的提取物作为混合(Urease)抗原的混合物免疫产蛋母鸡，制备抗Hp的IgY抗体，但该抗原成分复杂，导致其免疫球蛋白的特异性和、针对性和抗体滴度不强高，往往由于菌体表面抗原的丢失或菌体突变，难以达到抑制幽门螺杆菌生长的目的产生的卵黄抗体；此外有人从幽门螺杆菌中分离脲酶，作为免疫原获得抗体，然而该抗体不能抑制幽门螺杆菌的定植。综上所述，需要新型抗体治疗技术的筛选开发，以此实现对幽门螺杆菌的综合防治。
【发明内容】
[0006]本发明正是针对现有技术中存在的不足和缺陷，提供一种安全、成本低、具有高效预防和治疗幽门螺杆菌的一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法。
[0007]本发明的另外一个目的是提供以上所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的应用。
[0008]本发明的具体技术方案如下:
[0009]—种抑制尿素酶脲酶活性卵黄抗体的制备方法，该方法包括以下步骤:先将幽门螺杆菌脲酶B亚基基因1710bp进行基因突变，再将其亚克隆到原核表达载体，并形成融合表达质粒pET32a-ureB ;将质粒pET32a_ureB转化大肠杆菌中并形成基因工程菌(该基因工程菌的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年10月15日，保藏编号为CGMCC N0:11509，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli)，将基因工程菌进行分离和纯化，得幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白；再将幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白与佐剂混合，制成重组幽门螺杆菌脲酶B亚基微球疫苗，通过2-5点肌肉免疫3-4次产蛋鸡；收集鸡蛋，采用罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA和Western blotting技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。
[0010]所述的大肠杆菌表达产物中80-95%的重组脲酶B蛋白是幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白，通过使用N1-NTA树脂纯化后的重组幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白，蛋白纯度SDS-PAGE电泳后灰度扫描其纯度在85-98%。
[0011]所述的佐剂中含胞壁酰二肽5-50ug/g、脂多糖5-40ug/g。
[0012]幽门螺杆菌B亚基片段微球疫苗的制备:所述的重组脲酶B亚基微球疫苗含有液体石錯和span 80，将液体石錯和span 80a按其体积比为5_9:1，并400_600rpm机械搅拌约8-12min，混合均勾制备油相。将纯化蛋白抗原与胞壁酰二肽和脂多糖溶于20mg/ml的海藻酸钠溶液中，纯化蛋白抗原、胞壁酰二肽和脂多糖的终浓度分别为150-550ug/ml、5-50ug/ml和5_40ug/ml，混勾，通过直径0.03-0.05mm的孔径喷雾干燥器喷出，于上述液体石錯和span 80a的油相中搅拌，乳化3_6h，既得微球疫苗。
[0013]所述的鸡蛋中，其抗脲酶卵黄抗体滴度达到1:10000以上。
[0014]所述的卵黄抗体的罐组式逆流提取，于30°C以下条件多罐逆流提取6_8h，提取率达到 90-98%。
[0015]所述的罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，第一次，在30°C以下取蛋黄液与UP水按1:2-5体积比混匀，缓慢搅拌l-2h, 12000rpm离心10_15min，收集上清液A。第二次，取第一次离心沉淀8-20倍重量的UP水重悬第一次离心沉淀，在30°C以下混匀，搅拌l-2h, 12000rpm离心10_15min，收集上清液。将此次的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5比例在30°C以下混匀，用UP水补足上清液，搅拌l_2h，12000rpm离心10_15min，收集上清液B。第三次取8-20倍第二次离心获得的沉淀重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30°C以下混匀，搅拌l_2h，12000rpm离心10_15min，收集上清液，沉淀另处理，此次获得的上清液与第一次提取离心后的沉淀在30°C以下混勾，搅拌l-2h, 12000rpm离心10_15min，收集上清液。此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5体积比在30°C以下混匀，用UP水补足上清液，搅拌l_2h，12000rpm离心10_15min，收集上清液C。合并上清液A、上清液B和上清液C。用HCI调节pH至5-5.5，搅拌混匀，加入固体氯化钠达到8-9.5%，4°C静置6_10h，12000rpm离心10_15min，收集沉淀，纯度达到80%以上，抗体滴度达1:104_1:106。将沉淀冷冻干燥形成干粉后保存，_20°C保存一年其活力保持在90%左右。
[0016]免疫产蛋鸡:将制备的重组脲酶B亚基微球疫苗在胸部以2-5点肌肉注射免疫SPF级产蛋鸡，初免剂量为200-400ug/只；间隔1-2周加强免疫一次，免疫剂量调整为100-200ug/只，第二次加强免疫后一周开始收集鸡蛋；检测抗体滴度，此后当卵黄抗体滴度低于104时可进行强化免疫，免疫剂量为200-600ug/只。通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
[0017]本发明的积极效果体现在:
[0018](一)在制备疫苗过程中，采用基因工程技术实现了重组脲酶B亚基在体外大量的可溶性表达，克服了常规脲酶B亚基原核表达出现包涵体的状况，保持幽门螺杆菌脲酶B亚基的天然构象，表达水平高，后续纯化简便。采用罐组式逆流提取技术，节能减排，节省了时间，降低了成本。制备的抗幽门螺杆菌脲酶B亚基的卵黄抗体，在体内对幽门螺杆菌感染的动物模型和病人，体现出很好的保护效果。
[0019]( 二 )将卵黄抗体与牛奶或酸牛奶混合，对幽门螺杆菌感染小鼠的治愈率达到94%