一种猪elf4蛋白卵黄抗体的制备方法
【专利摘要】一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，首选扩增得到ELF4基因片段，与pET28a载体连接，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a?pELF4；用诱导物IPTG诱导该重组表达菌株，获得融合蛋白；向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β?丙内酯，将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG混合后，采用所得混合物对蛋鸡进行免疫，从蛋鸡所下鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。本发明方法相对简单，抗体产量大，制备成本低，所得到的种猪ELF4蛋白卵黄抗体效价高，适合工业化生产。
【专利说明】
一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种抗体，具体的说是一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] ETS(E26 transformationspecific)家族分子是多细胞生物的一类转录因子，因 最早在禽骨髓成红细胞增生症病毒E26所表达的融合蛋白中发现的癌基因编码的蛋白而 得名。该家族蛋白结构高度保守，其有一段85aa序列能够特异性地结合于DNA共有基序 GGAA/TiLF^ETflike factor 4)是 ETS 家族的一员，早期被命名为骨髓 elf-l(E74-like factor 1)样因子(Myeloid elf-1-like factor，MEF)，在上皮细胞中能够组成性的激活溶 菌酶基因、上调人邱方御素 2基因的转录水平，而且被认为是X染色体上一个潜在的肿瘤抑制 子。在基础水平，ELF4的转录受转录因子Spl的调控，其反式激活功能部分被前髓细胞性白 血病蛋白所调节。同时，受小泛素相关修饰蛋白（Small ubiquitin-related modifier， SUMO)的调控，人源ELF4的第657位赖氨酸被泛素化，导致ELF4对溶菌酶基因的转录反式激 活能力被抑制。转录因子ELF4还参与细胞多种生理或病理过程，如肿瘤发生、DNA损伤反应 和细胞周期调控。
[0003] 目前，被克隆得到该基因序列的种属动物仅来源于人、小鼠和牛，猪源ELF4基因序 列及其其编码蛋白的原核表达没有相关报道，目前亦无猪源ELF4蛋白抗体相关商品化产 品，鉴于该蛋白在抗感染免疫方面的重要作用，本发明属于首次得到猪的ELF4基因序列，采 用优化的免疫原制备方案，免疫蛋鸡制备相应的卵黄抗体，该抗体可以用于检测猪源ELF4 蛋白，作为工具，开展猪ELF4深入的功能研究具有特异性强和敏感性高等特点。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的方 法。
[0005] -种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 步骤一、以猪肾细胞(PK15细胞系)为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到 猪ELF4(pELF4)基因片段，将扩增得到猪ELF4(pELF4)基因片段与pET28a载体连接并转化至 Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4,所述猪ELF4基 因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集 菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a_pELF4; 步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得 到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 步骤四、向融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4°C下24-48 h，再置于 37°C下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白； 步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，得到混合物 A;采用所得混合物A对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收 集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。
[0006] 步骤一中所述RT-PCR法扩增所用引物为：
步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白 的条件为:在37 °C下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至0D_值为1 · 6时，加入 终浓度为lmm〇L/L的IPTG诱导6-8h。
[0007] 步骤四中所述将融合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入 终质量浓度为〇. 05%的β-丙内酯，先置于4°C下24 h，再置于37°C下2h。
[0008] 步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混 合顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/ min的转速搅拌乳化1-2h。
[0009] 步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，进行注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于 初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/ 只。
[0010] 有益效果是： 1、本发明提取的包涵体重组蛋白ELF4具有良好的免疫原性和反应原性。
[0011] 2、本发明所采用ISA71VG为佐剂的免疫原制备工艺能够很好的提示蛋白的免疫原 性，是一种很好的用于家禽免疫接种过的免疫原配方，该抗原能在机体内缓释放，延长机体 的免疫反应期，提高抗体产量。
[0012] 3、本发明提取的抗猪ELF4蛋白卵黄抗体可较好地结合猪ELF4蛋白。
[0013] 4、本发明提取方法相对简单，抗体产量大，制备成本低，所得到的抗体效价高，适 合工业化生产。
【附图说明】
[0014] 图1是猪ELF4基因（PELF4)的RT-PCR扩增电泳图； 图中标记是:M，Marker; 1，PELF4; 图2是重组猪ELF4基因表达载体pET28a-ELF4的酶切鉴定电泳图； 图中标记是:Μ，Marker; 1，PET28a-PELF4; 图3是原核表达重组猪ELF4蛋白的SDS-PAGE分析结果图； 图中标记是：M，Marker; 1，PET28a-PELF4诱上清；2，PET28a-PELF4诱IB; 3，PET28a-PELF4未诱上清；4，PET28a-PELF4未诱IB; 5，PET28a-空载诱导上清；6，PET28a-空载诱导IB; 图4是表达重组猪ELF4蛋白的Western blot鉴定图； 图中标记是：M，Marker; 1，PET28a-PELF4诱上清；2，PET28a-PELF4诱IB; 3，PET28a-PELF4未诱上清；4，PET28a-PELF4未诱IB; 5，PET28a-空载诱导上清；6，PET28a-空载诱导IB; 图5是Western blot检测不同稀释倍数稀释的猪ELF4特异性卵黄抗体结果图。
[0015] 图中标记是:Μ，Marker; 1、抗体稀释2000倍，2、抗体稀释4000倍;3、抗体稀释8000 倍。
【具体实施方式】
[0016] -种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 步骤一、猪转录调节因子ELF4基因的克隆与测序及其重组表达菌的构建： (1)以猪肾细胞的总RNA为模板，合成第一链cDNA，利用primer prime5.0软件设对 引物:PELF4-S: ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT(下划线序列为EcoRI位点），pELF4_ R：ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG(下划线序列为HindΙΠ 位点），采用RT-PCR 方法扩增得到猪ELF4基因片段。RNA进过随机引物反转录成cDNA后，进行PCR扩增。
[0017] (2 )将PCR产物利用价oR I和[fld m双酶切后与经过价oR I和[fld m双酶切的 pET28a载体连接。连接产物转化至Rosetta(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落克隆扩大培养 提取质粒采用fcoRI和^?/κΠΠ 双酶切鉴定，将双酶切鉴定阳性的质粒进行序列测定，酶切产 物采用1%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性质粒送至华大基因进行序列测定，阳性菌株命名为 Rosetta(DE3)/pET28a-pELF40
[0018] (3)利用LaSergen7.1软件分析测定的猪ELF4基因，该基因开发阅读框长度为1989 bp，编码662 aa，本发明所获得的猪ELF4基因具体核苷酸序列如SEQ No.l所示，该基因编码 的氨基酸序列如SEQ No.2所示。
[0019] 步骤二、重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4诱导表达及蛋白的纯化： (1)重组表达菌R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4，采用LB培养培养，在37°C，终浓度为ImM 的IPTG诱导6-8h。
[0020] (2)8000 r/min，4°C离心 10min，收集菌体； (3)每1L菌液的菌体加入裂解液20mL，37°C，100 r/min，裂解lh。所述裂解液的配制方 法为：50禮1^8-!1(：1?!17.5缓冲液中含有：1%(￥/^)了6邙111〇1?七7?6陬-40、0.5%(￥八） 脱氧胆酸钠、150 mM氯化钠、1% SDS(W/V)、0.1 mM苯甲基磺酰氟W/V)。
[0021] (4)将上述裂解液超声波破碎，条件为:能量值60%，每间隔5s超声5s，总时长为lh。
[0022] (5)8000 r/min，4°C，离心 15min，收集沉淀蛋白； (6)往沉淀蛋白中加入roS缓冲液20mL; (7 )超声裂解:能量值60%，每间隔5 s超声5 s，总时长为lh。
[0023] (8)8000 以11^11，4。(：，离心151^11，收集沉淀蛋白； (9)往沉淀蛋白中加入roS缓冲液5mL，漩涡振荡制备得到纯化的猪ELF4重组蛋白悬液。
[0024] 步骤三、获得了一种用于家禽的免疫原的制备与免疫程序和接种方式： (1)免疫原的灭活处理：向纯化的蛋白中加入终浓度为〇. 05%的β-丙内酯，于4°C，作用 24 h，37°C，作用2h，将蛋白中的外源污染微生物灭活。
[0025] (2 )免疫原的乳化制备：将蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以3: 7的体积比例混合，混合 顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/min 的转速搅拌乳化2h。
[0026] (3)蛋鸡的免疫:对来航鸡蛋鸡进行胸部肌肉注射，剂量为0.5mL/只。依次于初次 免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/只。抽 取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当 抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。
[0027] 步骤四、本发明获得了一种ELF4卵黄抗体提取工艺： (1)在无菌的条件下，用蛋黄分离器分离卵黄与卵白。
[0028] (2)向100mL卵黄中加入400mL pH为7.9的Tris-NaCl，1.2%(W/V)的泊洛沙姆溶液 (1:4) ;500r/min，揽摔5min。
[0029] (3)室温静置1 h; (4) 弃沉淀，收集上清； (5) 1200〇1'/111；[11，4。0离心15111；[11; (7) 收集上清用0.45μπι滤膜过滤； (8) 滤过液采用超滤膜在6000r/min，4 °C离心15min，离心超滤。
[0030] (9)用含有体积分数为30%的甘油PBS缓冲液洗脱IgY抗体； (10)采用紫外分光光度计测定浓度，并用SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体纯度。利用 western blot分析抗体效价。
[0031] 实施例1 本实施例拟对猪ELF4蛋白基因进行克隆，构建原核表达载体pET28a-pELF4，表达和纯 化重组猪ELF4蛋白，并将其作为免疫原，免疫产蛋鸡，生产抗猪ELF4重组蛋白特异性IgY抗 体。
[0032] 1、引物设计与合成 根据人源的ELF4基因序列，使用软件Primer Prime5.0软件设计一对引物，用于扩增猪 ELF4 基因 DNA序列。pELF4-S: 5 ' -ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT-3 '（下划线序列为 五coRI位点），pELF4-R: 5 ' -ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG-3 '（下划线序列 为Hindm位点），引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
[0033] 2.猪ELF4基因的PCR扩增，采用RT-PCR方法扩增得到猪ELF4基因片段。
[0034] PCR反应体系如下： 试剂 体积 5XPrime STAR GXL Buffer 10yL dNTP Mix 4yL 上下游引物P，R lyL Prime STAR GXL DNA Polymerase lyL 模板 cDNA 2yL ddH20 31yL 总体系 50yL 反应参数:95°C预变性4min，98°C变性1〇8,60°(：退火3〇8,68°(：延伸21^11，35个循环，68 。(:延伸7min，4°C保存。
[0035] 3、PCR产物纯化，测浓度，酶切 PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，50min。凝胶成像系统进行观察，拍照。使用 Axygen公司PCR产物纯化试剂盒进行DNA的纯化，测定DNA浓度。
[0036] 4、纯化产物与pET28a载体连接与转化 连接体系如下： pET28a(经 EcoRI 和 Hindm 酶切）lyL 纯化的ELF4(经EcoRI和HindΙΠ 酶切）4yL Ligation Mix 5uL 混合后16°C连接过夜。
[0037] 连接产物转化Rosetta(DE3)感受态细胞，步骤如下： (1)从-80°C冰箱中取Rosetta感受态细胞悬液，手握住迅速解冻，至管中还有小部分呈 冰晶状态时，立即置冰上。
[0038] (2)超净台中，向感受态细胞中加入过夜的质粒DNA 5yL，用灭菌枪头将其轻轻轻 混匀，冰上放置30 min。
[0039] (3)42°C水浴中热击90秒，后迅速置于冰上冷却5 min。
[0040] (4)向管中加入800 yL无抗生素的LB液体培养基，37°C，220rpm振荡培养50min。
[0041 ] (5)将上述菌液12000 rpm离心lmin，超净台中，弃掉上清600 yL，剩余的300yL将 管底菌体吹均匀，分成两份分别涂布于含Amp的筛选平板上(其中一块板加50yL，另外一块 加250yL)正面向上放置lh，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37°C培养16h小时。 [0042] (6)次日观察菌落、挑取单菌落进行鉴定。
[0043] 5、重组质粒的提取 含有重组质粒的Rosetta菌在含有卡那霉素的LB液体培养基培养后，提质粒酶切鉴 定:参照Axygegen质粒提取试剂盒，操作如下： (1)取4 mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000g离心lmin，弃尽上清。
[0044] (2)加 250yL BufferSl，悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀。
[0045] (3)加250yL BufferS2,温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解， 直至形成透亮的溶液。此步不宜超过5min。
[0046] (4)加350yL BufferS3,温和并充分的上下翻转混合6-8次，12000g离心10min。
[0047] (5)吸取步骤（4)中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管），12000g离心 lmin，弃滤液， (6)将制备管置回离心管，加500yL BufferWl，12000g离心lmin，弃滤液。
[0048] (7)将制备管置回离心管，加700yL BufferW2，12000g离心lmin，弃滤液，以同样的 方法再用700yL BufferW2洗涤一次。弃滤液。
[0049] (8)将制备管置回2ml离心管中，12000g离心lmin。
[0050] (9)将制备管移回新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60-80yL Eluent或去离 子水，室温静置lmirul^OOOg离心lmin。
[0051 ] 6、重组质粒的酶切鉴定 重组质粒使用EcoRI和Hindm进行双酶切鉴定，酶切体系如下。酶切体系如下： 质粒 5yL EcoRI 0.4yL Hindm 0.4yL lOXBuffer(Q.Cut) 2yL ddH20 12.2yL 37 °C酶切反应15min，酶切产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产产物有2条带，一 条为5.7kb的空载体带，一条为1989bp的目的基因条带，阳性质粒测序鉴定开放阅读框准 确。
[0052] 7、ELF4基因的诱导温度的确定 (1)将双酶切和测序结果正确的阳性菌株5yL接种于含卡那霉素的5mL新鲜LB培养基 中，37°C，220r/min培养过夜。
[0053] (2)把培养过夜的菌液，按1:10分加到4mL含卡那霉素的LB液体培养基中（例如4mL 的LB中加40yL菌液），37 °C，220rpm，2h。
[0054] (3)当菌液0D600nm=l · 6~1 · 8时，每管加入终浓度为1mmoL/L IPTG。
[0055] (4)分别置于25 °C、28 °C、37 °C，200 r/min诱导6-8 h。
[0056] (5)4°C，8000rpm离心，15min，弃上清，收集沉淀。
[0057] (6)向沉淀中加入适量菌体裂解液，悬浮。
[0058] (7)超声裂解lh。
[0059] (8)4°C，8000g离心15min，收集上清和包涵体。
[0060] (9)SDS_PAGE电泳检测蛋白表达情况，具体步骤如下： ①制胶:洗净玻璃板，固定在制胶器上，按分离胶配方，依次加入各试剂，最后加入过硫 酸铵，上下颠倒混匀后，快速注入两玻璃板之间，胶上覆盖一层异丙醇，静置30min。倾去上 层异丙醇，吸水纸吸干残留的双蒸水，加入配置好的5%浓缩胶，水平插入梳子，静置2h垂 直移去梳子，去掉制胶器，移入电泳槽，在内、外槽加入电泳缓冲液，电泳液没过胶孔。
[0061] ②上样：样品按照1:1比例加入电泳上样缓冲液，涡旋混匀，沸水浴lOmin， 8000rpm离心lmin，取上清。使用移液枪上样，10μL7孔。电泳，浓缩胶电压为80V，当溴酚蓝 进入分离胶时，提高电压至120V，溴酚蓝至胶底部lcm，停止电泳。
[0062] ③染色：放于加有考马斯亮蓝染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上， 转速约为45r/min，时间约3小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染脱色:染色结束后，取凝胶 置于脱色液中，摇床上进行脱色，直至北景变淡。
[0063] ④脱色:取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床 上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。
[0064] 8、ELF4基因最佳诱导剂浓度的确定 当菌液0D600nm=1.6~1.8时，选择最佳诱导温度，不同IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、 1.0 mmoL/L)，220 r/min诱导6-8 h，方法同上进行SDS-PAGE电泳。
[0065] 9、ELF4最佳诱导时间的确定 当菌液0D600nm=l .6~1.8时，选择最佳诱导温度和最佳诱导剂浓度，分别诱导不同时 间（1 h、2 h、4 h、6h和8 h)，方法同上进行SDS-PAGE电泳。
[0066] 10、重组蛋白可溶性分析 在IPTG最佳诱导浓度和诱导时间的条件下，诱导培养含有Rosetta(DE3)/pET28a-ELF4菌，4°C，8000rpm，15min。菌体在冰浴中超声破碎（间隔 5s，60min)，4°C，8000 rpm ，15min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析。分别取pET28a空载体诱导前、后上清和不 溶部分，各取lml作为对照。
[0067] 11、重组蛋白ELF4的Western blot分析 SDS-PAGE电泳分离目的蛋白，操作如上，电泳后，进行Western blot鉴定，操作如下： (1)转膜前准备:剪与胶相应大小的PVDF膜(Mi 11 ipore公司），用100%甲醇处理15S，用 Mi 11 iQ H20处理2min，用转印缓冲液处理5min。
[0068] (2)转膜:按照自下而上依次放置1张厚滤纸、PVDF膜、凝胶、1张厚滤纸的顺序，将 其叠放于电转移仪器上进行转移，转移参数:l〇V，25min。
[0069] (3)封闭：2%脱脂奶粉-PBS，覆盖整张膜为宜，37°C，57r/min，lh。
[0070] (4)洗膜:摇床45-57r/min，PBST 洗涤 5min。
[0071] (5)-抗反应:Anti-his mAb多克隆抗体，用2%脱脂奶粉-PBS 1:2000稀释，总体积 以覆盖整张膜为宜，摇床45r/min，37°C，lh。
[0072] (6)洗膜:PBST 洗涤 3次，摇床 45r/min，5min/次。
[0073] (7)二抗反应：用2%脱脂奶粉-PBS，按照1:4000稀释HRP-SPA。总体积覆盖整张膜 为宜，摇床45r/min，37°C，lh; (8)洗膜:摇床45r/min，PBST洗涤3次，5min/次;最后一次不用立即倒掉PBST溶液。先配 好显色液。
[0074] (9)显色：（1)配制显色液lmL:具体根据说明书进行；（2)显色:倒掉PBST溶液，用枪 吸显色液往膜上轻轻吹，反复操作，直到目的条带显色，用自来水冲洗终止反应。
[0075] (10)拍照记录结果。
[0076] 12、表达蛋白的纯化 在最佳IPTG诱导浓度和诱导时间下，诱导培养含有ELF4的菌（100mL)，8000r/min离心 15min，收集菌体沉淀。纯化步骤如下： (1)洗涤菌体:每管分别加入15 mL的PBS，漩祸振荡lmin，悬起菌体，8000r/min离心15 min，去掉上清。
[0077] (2)超声裂解:往离心管中分别加入15mL的roS，将菌体漩涡振荡lmin，悬起，分别 进行超声，每次超5s，间隔5s，每管合计1 h。
[0078] (3)离心洗涤:将超声裂解产物4°C，8000r/min离心15min，弃掉上清。
[0079] (4)二次超声：将第一次超声后的沉淀，用20mL包涵体洗涤液将沉淀悬起，漩涡振 荡lmin，进行超声，每次超5s，间隔5s，合计1 h。
[0080] (5)离心洗涤:将超声裂解产物4°C，8000r/min离心15min，弃掉上清。沉淀即为包 涵体蛋白。用包涵体溶解液将包涵体溶解，UV法测定重组蛋白含量，4°C保存。
[0081] 13、免疫原制备及免疫 (1)免疫原的灭活处理：向纯化的蛋白中加入终浓度为〇. 05%的β_丙内酯，于4°C，作用 24 h，37°C，作用2h，将蛋白中的外源污染微生物灭活。
[0082] (2 )免疫原的乳化制备：将蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以3: 7的体积比例混合，混合 顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/min 的转速搅拌乳化2h。
[0083] (3)蛋鸡的免疫:对来航鸡蛋鸡进行胸部肌肉注射，剂量为0.5mL/只。依次于初次 免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/只。抽 取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当 抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体。
[0084] 14、IgY抗体提取与鉴定 (1)在无菌的条件下，用蛋黄分离器分离卵黄与卵白。
[0085] (2)向100mL卵黄中加入400mL pH为7.9的Tris-NaCl，1.2%(W/V)的泊洛沙姆溶液 (1:4) ;500r/min，揽摔5min。
[0086] (3)室温静置1 h; (4) 弃沉淀，收集上清； (5) 1200〇1'/111；[11，4。0离心15111；[11; (7) 收集上清用0.45μπι滤膜过滤； (8) 滤过液采用超滤膜6000r/min，4 °C离心15min，离心超滤。
[0087] (9)用含有体积分数为30%的甘油PBS缓冲液洗脱IgY抗体； (10)采用紫外分光光度计测定浓度，并用SDS-PAGE方法鉴定分离的抗体纯度。
[0088] 15、IgY抗体效价的测定 Western blot法测定抗pELF4抗体效价，操作步骤如下： SDS-PAGE电泳分离ELF4重组蛋白，转膜后进行Western blot鉴定，方法如上述Western blot步骤。一抗为本试验所制备Anti_pELF4 IgY抗体，抗体分别作1:1000、1:2000、1:4000、 1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000稀释，每个稀释度的一抗对应一条转印膜，每 条膜加入的二抗为HRP-兔抗鸡IgY二抗稀释度为1:4000。
[0089] 16、结果 (1)经PCR扩增得到猪ELF4基因片段大小为1989bp(图1)，重组载体pET28a-pELF4经 EcoRI和Hindm双酶切鉴定可见2条特异性条带，一条为空载体(分子量大小约为5.7kb)，一 条为1989bp的目的基因条带（图2)。经序列测定，猪ELF4开放阅读全长为1989bp，编码662氨 基酸，其详细序列见SEQ No.l。
[0090] (2)诱导表达的重组猪ELF4蛋白分子量大小约为95kDa，蛋白的表达形式为可溶性 (上清)和包涵体(IB)两种（图3)。
[0091] (3)提纯IgY的免疫活性检测:将所提取的IgY抗体以不同的稀释倍数（1:2000、1: 8000、1:8000)与表达的pELF4蛋白进行Western blot检测，如图4所示，低稀释倍数的条带 很浓，抗体稀释到8000倍时，与抗原结合出现明显条带，说明所制备的抗体能够用检测猪源 ELF4蛋白。
[0092] (4)Western blot鉴定与效价测定 重组蛋白经SDS-PAGE电泳后，进行转膜，使用抗ELF4-IgY抗体作为一抗，检测抗体 特异性。提取的抗ELF4-IgY抗体可较好地结合ELF4蛋白（75kD)，经稀释测定猪ELF4特异性 IgY抗体滴度为64000倍。
[0093] 实施例2 一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 步骤一、以猪肾细胞(PK15细胞系)为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到 猪ELF4(pELF4)基因片段，将扩增得到猪ELF4(pELF4)基因片段与pET28a载体连接并转化至 Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4,所述猪ELF4基 因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集 菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4; 步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得 到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4°C下24 h，再 置于37°C下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白； 步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混 合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4 特异性卵黄抗体效价，检测抗体效价达到60000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出 猪ELF4蛋白卵黄抗体。
[0094] 步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的 蛋白的条件为:在37°C下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至0D6Q()值为1.6时， 加入终浓度为lmm〇L/L的IPTG诱导6h。
[0095] 步骤四中所述将融合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入 终质量浓度为〇. 05%的β-丙内酯，先置于4°C下24 h，再置于37°C下2h。
[0096] 步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混 合顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/ min的转速搅拌乳化lh。
[0097] 步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，进行注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于 初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/ 只。
[0098] 实施例3 一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 步骤一、以猪肾细胞(PK15细胞系)为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到 猪ELF4(pELF4)基因片段，将扩增得到猪ELF4(pELF4)基因片段与pET28a载体连接并转化至 Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4,所述猪ELF4基 因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集 菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a_pELF4; 步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得 到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4 °C下48 h，再置 于37°C下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白； 步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混 合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4 特异性卵黄抗体效价，抗体效价达到40000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪 ELF4蛋白卵黄抗体。
[0099] 步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的 蛋白的条件为:在37°C下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至0D6Q()值为1.6时， 加入终浓度为lmm〇L/L的IPTG诱导8h。
[0100] 步骤四中所述将融合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入 终质量浓度为〇. 05%的β-丙内酯，先置于4°C下24 h，再置于37°C下2h。
[0101] 步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混 合顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/ min的转速搅拌乳化2h。
[0102] 步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，进行注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于 初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/ 只。
[0103] 实施例4 一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤： 步骤一、以猪肾细胞(PK15细胞系)为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到 猪ELF4(pELF4)基因片段，将扩增得到猪ELF4(pELF4)基因片段与pET28a载体连接并转化至 Rosetta(DE3)感受态细胞，获得重组表达菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4,所述猪ELF4基 因核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示； 步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集 菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a_pELF4; 步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得 到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 步骤四、向纯化的融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4 °C下40 h，再置 于37°C下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白； 步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合后，采用所得混 合物对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4 特异性卵黄抗体效价，抗体效价达到80000倍，从鸡蛋中提取收集卵黄抗体，即制备出猪 ELF4蛋白卵黄抗体。
[0104] 步骤二中所述用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的 蛋白的条件为:在37°C下，将重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至0D 6Q()值为1.6时， 加入终浓度为lmm〇L/L的IPTG诱导7h。
[0105] 步骤四中所述将融合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入 终质量浓度为〇. 05%的β-丙内酯，先置于4°C下24 h，再置于37°C下2h。
[0106] 步骤五中所述将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混 合顺序为:将蛋白溶液缓慢加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为〇. 5mg/mL，同时以14000r/ min的转速搅拌乳化1.5h。
[01 07]步骤五中所述对蛋鸡进行免疫的方法为，进行注射免疫，剂量为0.5mL/只；依次于 初次免疫后第21天和51天，进行第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和lmL/ 只。
[0108]以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其
【主权项】
1. 一种猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于:包括以下步骤： 步骤一、以猪肾PKl 5细胞系细胞为材料，提取总RNA为模板，采用RT-PCR法扩增得到猪 ELF4基因片段，将扩增得到猪ELF4基因片段与pET28a载体连接并转化至Rosetta (DE3)感受 态细胞，获得重组表达菌株R〇setta(DE3 )/pET28a-pELF4;所述猪ELF4基因核苷酸序列列如 SEQ ID No. 1所示； 步骤二、用诱导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白，收集 菌体，获得表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a_pELF4; 步骤三、从表达目的蛋白的重组表达菌株R〇setta(DE3)/pET28a-pELF4中分离纯化得 到融合蛋白；所得融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示； 步骤四、向融合蛋白中加入终浓度为0.05%的β-丙内酯，先置于4°C下24-48 h，再置于 37°C下2h，最后将融合蛋白中的外源污染微生物灭活，得到处理后的蛋白； 步骤五、将处理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3: 7的比例混合后，得到混合物 A;采用所得混合物A对蛋鸡进行免疫，抽取第3次免疫后7天至30天的鸡蛋采用Western blot方法检测ELF4特异性卵黄抗体效价，当抗体效价达到16000倍以上时，从鸡蛋中提取收 集卵黄抗体，即制备出猪ELF4蛋白卵黄抗体。2. 如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于：步骤一中所述RT-PCR法扩增所用引物为： PELF4-S：ACTGAATTCATGGCTATTACCCTGCAGCCCAGT； PELF4-R：ACTAAGCTTTTATCATATGTCATGGGGCTCCATCTTAATG。3. 如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于:步骤二中所述用诱 导物IPTG诱导重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4表达目的蛋白的条件为:在37°C下，将 重组菌株Rosetta(DE3)/pET28a-pELF4培养至0D_值为1.6时，加入终浓度为1mmoL/L的 IPTG 诱导 6-8h。4. 如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于:步骤四中所述将融 合蛋白中的外源污染微生物灭活的方法为：向融合蛋白中加入终质量浓度为0.05%的β-丙 内酯，先置于4°C下24 h，再置于37°C下2h。5. 如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于:步骤五中所述将处 理后的蛋白与疫苗佐剂ISA71 VG以体积比3:7的比例混合的混合顺序为:将蛋白溶液缓慢 加入到佐剂溶液中，至蛋白终浓度为0.5mg/mL，同时以14000r/min的转速搅拌乳化1-2h。6. 如权利要求1所述猪ELF4蛋白卵黄抗体的制备方法，其特征在于:步骤五中所述对蛋 鸡进行免疫的方法为，注射免疫，剂量为〇. 5mL/只；依次于初次免疫后第21天和51天，进行 第2次和第3次加强免疫，免疫剂量依次为0.5mL/只和ImL/只。
【文档编号】C07K16/02GK105906713SQ201610199701
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】唐青海, 阚云超, 姚伦广, 王瑾, 唐存多, 谷雅静, 李晓楠, 李羽, 焦铸锦, 李丹丹, 刘宗才
【申请人】南阳师范学院