一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，特点是在PVC底板上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫，该结合垫上包被有所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体一胶体金标记物，该硝酸纤维素膜上分别包被有恶臭假单胞菌超声波破碎液构成的检测线和兔抗鸡卵黄抗体构成的质控线，优点是灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速、准确性高。
【专利说明】一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫化学检测技术，尤其是涉及一种基于卵黄抗体的胶体金免疫层析 技术用以快速检测环境、食品、人和动物各种组织，血液及粪便样品中恶臭假单胞菌的检测 试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 假单胞菌属是微生物的重要类群，也是自然界分布最广泛的微生物之一。 恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)属假单胞菌属（Pseudomonas)，假单胞菌科 (Pseudomonadaceae)，为革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、海水、淡水动植物体表及各种含 蛋白食品中，为人或动物源性或机会致病菌。目前，国内也陆续报道了一些由恶臭假单胞 菌引起的养殖鱼类和甲壳动物的疾病，如欧洲鳗（Anguilla anguilla)的烂鳃病、大黄鱼 (Pseudosciaena crocea)的肝肾白点病，罗氏沼奸（Macrobrachium rosenbergii)的黑觸 病及三抚梭子蟹（Portunus trituberculatus)的牛奶病等，这些疾病一旦爆发，传播迅速， 死亡率高，给养殖产业造成了巨大的损失。环境中的恶臭假单胞菌也可能随食物进入肠道， 在一定条件下该菌异常增殖，破坏了肠道内正常菌群的平衡而造成鱼体发病，已经成为养 殖鱼类的重要病原。同时恶臭假单胞菌也是人的条件致病菌，在一定条件下攻击机体免疫 力低下人群，该菌感染人体自溶后释放出内毒素可致中毒症状，多系统感染，败血症，甚至 感染性休克。恶臭假单胞菌为一种人畜共患病菌，近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用， 恶臭假单胞菌的感染有上升趋势，且该菌对多种抗菌药物具有较高的耐药性，因此，若能确 定病因，及时对症下药，势必能给养殖产业减少损失，同时，在医学方面也具有重要意义。
[0003] 目前，病原体的检测方法主要有分离培养、电镜观察、PCR、ELISA、色谱分析等，这 些方法多耗时耗力，需要专用场地和仪器设备，需要专业人员操作。对于恶臭假单胞菌感 染，根据微生物检测标准需先对其进行增菌实验，挑选特定菌株用全自动微生物分析仪分 析鉴定，整个过程操作繁琐，而且需要专业人员在无菌条件下进行，结果也需数天才能获 得，不利于对病源的确定及病情的及时控制。
[0004] 胶体金免疫层析试验（gold-immunochromatography assay GICA)是 20 世纪 80 年代开始发展起来的新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，基 于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低 等优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方面，都已 经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测各种病原和有毒有害物质的试纸条。但是，目前 国内外还没有公开任何关于恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法的相关研究报道。
[0005] 鸡卵黄抗体即卵黄中的免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk, IgY)，是针对特定 抗原的，具有持续效价的高亲和力抗体。用鸡做宿主来产生抗特定抗原的IgY，饲养简单，无 需采血，只需使用少量抗原即可产生大量抗体，从卵黄中提取的IgY纯度高、含量大。在疾 病的检测、诊断方面，IgY因免疫学特性独特，动物种系发生学距离远，其特异性和针对性较 哺乳动物抗体更强，应用于免疫诊断中，可减少假阳性的出现，从而提高检测的特异性，是 近年来新兴的研究领域。但是，目前国内外还没有公开任何关于恶臭假单胞菌IgY的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金免疫层析技术的特异性强、灵 敏度高、检测速度快、成本低并且操作简便的恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法，满足 了现场快速检测的需求。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种恶臭假单胞菌检测试纸条， 所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸 水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假单胞菌卵黄抗体_胶体金标记物，所述的硝酸纤维 素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY) 包被的质控线。
[0008] 所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将将抗恶臭假 单胞菌卵黄抗体与胶体金溶液（颗粒直径为25-50nm)按6-8 ii g : ImL混合，在pH 5. 4的条 件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加入加含IOwt%的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作 为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚 物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体，取离心 管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物。
[0009] 一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0010] ⑴样品垫的制备
[0011] 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖、Iwt%吐 温-20的0. OlM pH 7. 2的PBS缓冲液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到样品垫，真 空封装，4 °C保存备用；
[0012] (2)特定包被的结合垫的制备
[0013] 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖，Iwt%吐 温-20的0. OlM pH 7. 2的PBS缓冲液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纤维纸上均匀喷涂10-20 y L的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥 l-2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用；
[0014] (3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备
[0015] 将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，将 兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤 维膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封装，4°C保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述 的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；
[0016] (4)试纸条的制备
[0017] 将步骤⑴得到的样品垫、步骤⑵得到的特定包被的结合垫、步骤（3)得到的特 定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6_宽的细条，即得恶 臭假单胞菌检测试纸条，真空封装，4°C保存。
[0018] 所述的恶臭假单胞菌抗原的制备方法如下：取实验室_80°C保存的恶臭假单胞菌 种，在LB固体培养基中划线活化，28°C倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL LB液体 培养基的试管中，28°C，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用LB液体培养基按1 : 100稀 释到三角烧瓶中，28°C，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其0D600值，当其0D600值达到 0. 4-0. 6时停止培养。将培养的菌液在4°C进行5000rpm离心lOmin，弃上清，下层沉淀用 pH 7. 2的0. OlM PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心lOmin，沉淀用PBS重复上述洗涤2次， 最终得到的沉淀即为恶臭假单胞菌抗原。
[0019] 所述的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：
[0020] (1)抗恶臭假单胞菌卵黄抗体的制备
[0021] 将上述恶臭假单胞菌抗原与无菌生理盐水混合得到恶臭假单胞菌悬液，加入甲 醛使甲醛体积终浓度达0. 5%，然后37°C恒温水浴灭活24h，即得到灭活的恶臭假单胞菌 抗原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的恶臭假单胞菌抗原和弗氏完全佐 剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免疫， 每只母鸡免疫剂量为4X IO9CFU, 15-20天后，将灭活的恶臭假单胞菌抗原和弗氏不完全 佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为 2X IO9CFU,加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效价，当卵 黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体；
[0022] (2)胶体金标记抗恶臭假单胞菌卵黄抗体
[0023] 将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25_50nm的胶体金溶液按 6-81^ :11111混合，在口115.4的条件下通过搅拌振荡3〇-6〇1]1；[11使其结合，加含10￥1:%的牛 血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗恶臭 假单胞菌卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标 记物，用含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖，0. 02wt%叠氮化钠的pH 7. 2 的0. OlM PBS重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。
[0024] 用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤（1)分离得到 的卵黄，按质量比1 : 9加入？115.0的0.0511的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后41：静置 过夜，8000g离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，IOOOOg离 心20min，沉淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40 %，4°C 搅拌过夜，IOOOOg离心20min，沉淀用少量pH 7. 2的0. OlM的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓 冲液中透析即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体。
[0025] 步骤（2)中胶体金制备方法如下：将IOOmL 0. Olwt%的氯金酸溶液，加热煮沸后， 边搅拌边加入l_2mL lwt%柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至 颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至IOOmL，无菌密封，4°C避光保存。
[0026] 所述的检测线距离所述的结合垫6-8mm ;所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm， 所述的检测线和所述的质控线的宽度分别为〇. 8-lmm，两条线相距为5mm。
[0027] 所述的LB液体培养基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，补 足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0028] 所述的LB固体培养基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl IOgJlC 脂15g，补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0029] 所述的 PBST 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，500 ii L吐温-20,补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；
[0030] 所述的 PBS 缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0? 2g、Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、 KH2PO4O. 2g，补足双蒸水至1L，调节pH至7. 2,高压灭菌；
[0031] 所述的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2. 604g、冰乙酸I. 095g，补足双蒸水 至1L，调pH至5. 0,高压灭菌。
[0032] 所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液的包被量为1-2 ii L/cm ;所述的兔抗鸡卵黄抗 体的包被量为1-2 U L/cm，所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液是将所述的恶臭假单胞菌抗 原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。
[0033] 本发明选用恶臭假单胞菌超声波破碎液作为检测线，抗恶臭假单胞菌特异性卵黄 抗体作为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有恶臭假单胞菌。通过 待检样品中的恶臭假单胞菌与包被于硝酸纤维膜上的恶臭假单胞菌抗原共同竞争结合抗 恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物。若待检样品中恶臭假单胞菌的量高于试纸条的检 测限，抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物与样品中恶臭假单胞菌全部结合，从而不 与固定在硝酸纤维膜上的菌液结合而不出现红色条带而显阳性；若待检样品中不含恶臭假 单胞菌或其量低于试纸条的检测限，抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物不能与样品 中恶臭假单胞菌全部结合，这样金标抗体在层析过程中会被固定在硝酸纤维素膜上的菌液 结合而出现红色条带而显阴性。因此，若待测样品试纸条的检测线和质控线同时出现红色 条带，则判断为阴性样品；若待测样品试纸条检测线不出现红色条带，同时质控线上出现红 色条带则判断为阳性样品；若质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。
[0034] 与现有技术相比，本发明的优点在于
[0035] 1、检测快速：整个检测过程只需3-5分钟，能够满足现场检测的需要。
[0036] 2、检测准确率高、特异性强：本反应与其他细菌没有交叉反应，检测准确性能达到 95%以上，与操作复杂的ELISA水平基本相同。
[0037] 3、携带方便，操作简便：本发明改变了对恶臭假单胞菌的检测必须由专业人员才 能进行检测的局限性，使各个养殖场及医院均可即时、即地进行检测。
[0038] 4、本发明的检测试纸条制备工艺简单，成本低廉，不需要任何特殊仪器、设备。
[0039] 5、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4°C可有效保存半年以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1为本发明试纸条的结构示意图，图中1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素 膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为PVC底板；
[0041] 图2为本发明试纸条的制备工艺流程图。
【具体实施方式】
[0042] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0043] 具体实施例1
[0044] 一种恶臭假单胞菌检测试纸条，如图1所示，该试纸条由PVC底板7和在PVC底板 7上依次搭接的样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3及吸水垫4 ;结合垫2上包被有抗恶臭 假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜3上分别设置有由恶臭假单胞菌抗原超 声波菌液包被的检测线5和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY)包被的质控线6。
[0045] 上述抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗恶臭假单胞 菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按6-8 ii g : ImL混合，在pH 5. 4的 条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含IOwt %的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作 为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚 物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体，取离心 管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物。
[0046] 具体实施例2
[0047] 快速检测恶臭假单胞菌胶体金试纸条的制备方法，如图2所示，其具体操作步骤 如下：
[0048] (1)恶臭假单胞菌的制备
[0049] 恶臭假单胞菌抗原的制备方法如下：取实验室_80°C保存的恶臭假单胞菌种，在 LB固体培养基中划线活化，28°C倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL LB液体培养基 的试管中，28°C，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用LB液体培养基按1 : 100稀释到三 角烧瓶中，28°C，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其0D600值，当其0D600值达到0. 4-0. 6 时停止培养。将培养的菌液在4°C进行5000rpm离心lOmin，弃上清，下层沉淀用pH 7. 2的 0. OlM PBS重悬洗涤，5000rpm离心lOmin，沉淀再次用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的 沉淀即为恶臭假单胞菌抗原。
[0050] (2)抗恶臭假单胞菌卵黄抗体的制备
[0051] 将上述恶臭假单胞菌抗原与无菌生理盐水混合得到恶臭假单胞菌悬液，加入甲醛 使甲醛体积终浓度达0. 5%，然后37°C恒温水浴灭活24h，即得到灭活的恶臭假单胞菌抗 原；取健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活的恶臭假单胞菌抗原用生理盐水稀释后 和弗氏完全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进 行基础免疫，每只母鸡免疫剂量为4X IO9CFU, 15-20天后，将灭活的恶臭假单胞菌抗原和弗 氏不完全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫 剂量为2X IO9CFU,加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，进行三次免疫后收集 鸡蛋测定效价，当卵黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法 纯化卵黄抗体。卵黄抗体的纯化的具体方法如下：称取适量卵黄，按质量比1 : 9加入pH 5. O的0. 05M乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4°C静置过夜，8000g离心20min，取上清液 加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，IOOOOg离心20min，沉淀用10-20倍卵黄质 量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40%，4°C搅拌过夜，IOOOOg离心20min，取 沉淀用少量pH 7.2的0. OlM PBS溶液重悬，在PBS溶液中透析即得到抗恶臭假单胞菌卵黄 抗体。
[0052] (3)胶体金标记抗恶臭假单胞菌卵黄抗体的方法
[0053] 用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金。用新制的去离子水配制IOOmL O.Olwt% 的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入l_2mL lwt%柠檬酸三钠溶液后迅速摇匀，继 续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色稳定后继续加热5-10min，冷却后补足失水至 IOOmL,无菌密封，4°C避光保存；
[0054] 将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按 6-8 iig: ImL混合，在pH 5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含IOwt %的牛 血清蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分 稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h去除未结合的卵黄抗 体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含Iwt % 牛血清白蛋白、2. 5wt%鹿糖、Iwt%海藻糖、0.02wt%叠氮化钠的pH 7.2的0? OIM PBS重悬 至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。
[0055] (4)结合垫的包被
[0056] 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖，Iwt%吐 温-20的pH 7. 2的0. OlM PBS缓冲液中30min后，37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纤维纸上均匀喷涂10-20 y L抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥 l-2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用。
[0057] (5)样品垫的处理
[0058] 将玻璃纤维纸浸泡于含Iwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、Iwt%海藻糖、Iwt%吐 温-20的pH 7. 2的0. OlM PBS缓冲液中30min后取出，37°C干燥2-3h即得到样品垫，真空 封装，4 °C保存备用。
[0059] (6)硝酸纤维膜的包被
[0060] 将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成检测线，包 被量为1-2U L/cm ;将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上形成质控线，包 被量为1-2 U L/cm，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封装，4°C 保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近 吸水垫端；恶臭假单胞菌超声波破碎液是将所述的恶臭假单胞菌抗原用PBS重悬，经超声 波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。
[0061] (7)试纸条组装
[0062] 将样品垫（1)、结合垫（2)、硝酸纤维膜（3)、吸水垫⑷按图2所示的顺序依次粘 附在PVC底板（7)上，PVC底板作为支撑载体，由下及上是由玻璃纤维纸组成的样品吸收 区，然后是吸附了胶体金所标记的卵黄抗体的玻璃纤维层，其次是硝酸纤维素膜，最上一层 是吸水层，由滤纸组成，外面用胶带封住，成为手持部分。各层之间均有I. 5_左右的重叠 交叉。将试纸条切成4-6_宽的小条，真空封装，4°C保存。
[0063] 其中步骤⑴中采用的LB液体培养基的配方如下：胰化蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，补足双蒸水至1L，调节pH至7. 4,高压灭菌；LB固体培养基的配方如下：胰化 蛋白胨1(^、酵母提取物5§、似(：11(^、琼脂15 §，补足双蒸水至11，调节？11至7.4，高压灭 菌。
[0064] 步骤（2)中的采用的乙酸-乙酸钠缓冲液配方如下：乙酸钠2. 604g、冰乙酸 I. 095g，补足双蒸水至1L，调pH至5. 0,高压灭菌。
[0065] 步骤（3)中采用的PBST缓冲液配制方法如下：NaCl 8g、KCl 0. 2g、 Na2HPO4 ? 12H202. 9g、KH2P040. 2g，500 ii L 吐温-20,补足双蒸水至 1L，调节 pH 至 7. 4,高压灭 菌。
[0066] 步骤（1) (2) (3) (4)、（5)中采用 PBS 缓冲液配制方法是：NaCl 8g、KCl 0. 2g、 Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g、KH2PO4O. 2g补足双蒸水至1L，调节pH至7. 2,高压灭菌。
[0067] 具体实施例3
[0068] 胶体金试纸条对临床样品的检测，具体步骤如下：
[0069] 从当地超市购买鳗鱼、梭子蟹、鲫鱼、虾等各种鱼类样品以及本地各池塘水 样，解剖取其肠，鳃和肝等样品共41份，将PBS缓冲液滴加于组织样品上，破碎组织， 2000-3000rpm离心5min后取上清液，将检测试纸条插入待检样品中，10分钟后观察结果： 若只在检测试纸条的质控区出现一条红线者为阳性结果，即样品中带有恶臭假单胞菌；若 试纸条的检测线和质控线同时出现红线者为阴性结果，即样品中不含有恶臭假单胞菌。每 个样品做5次重复，所有临床样品检测结果用酶联免疫吸附法（ELISA)进行比较。
[0070] 检测结果见表1，我们可以看到在收集的41份样品中，只有1份鳗鱼样品在试纸条 检测结果中呈阳性，对于其余各种鱼类样品均为阴性结果。所有检测样品均与ELISA结果 相同，说明两者具有高度一致性，胶体金试纸条的准确率高达100%。由此可见，这种研发的 恶臭假单胞菌胶体金试纸条是可行的，我们可以通过胶体金试纸条对各养殖场中的发病鱼 类进行检测确定病因，从而对症下药，及时防治，防止病情扩大，减少养殖户损失，也可以作 为在苗种引进时的一种初步筛选工具，这种胶体金试纸条方便实用，非常适合现场检测。同 时，由于恶臭假单胞菌是一种"人-畜-渔"共患病，因此，这种恶臭假单胞菌检测试纸条也 可以广泛应用于各大医院进行急诊。
[0071] 表1恶臭假单胞菌试纸条检测临床样品结果
[0072]
【权利要求】
1. 一种恶臭假单胞菌检测试纸条，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和在PVC底 板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假 单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声 波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY)包被的质控线。
2. 根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条，其特征在于所述的抗恶臭 假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下：将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体 金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按6-8 y g :lmL混合后，在pH 5. 4的条件下通过搅 拌振荡30-60min，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心 2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1. 5h，取离心管底部暗红色沉淀 即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物。
3. -种根据权利要求1所述的恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于包括 以下步骤： (1) 样品垫的制备 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖、lwt%吐 温-20的pH 7. 2的0. 01M PBS缓冲液中30min后取出，于37°C干燥2-3h即得到样品垫，真 空封装，4 °C保存备用； (2) 特定包被的结合垫的制备 将玻璃纤维纸浸泡于含lwt%牛血清白蛋白、2. 5wt%蔗糖、lwt%海藻糖，lwt%吐 温-20的pH7. 2的0. 01M PBS缓冲液中30min后，于37°C干燥l_2h后，在每平方厘米的玻 璃纤维纸上均匀喷涂10-20 y L的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥 l-2h，即得到结合垫，真空封装，4°C保存备用； (3) 特定包被的硝酸纤维素膜的制备 将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，将兔 抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤 维素膜，真空冷冻干燥1-1. 5h，真空封装，4°C保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所 述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端； (4) 试纸条的制备 将步骤（1)得到的样品垫、步骤（2)得到的特定包被的结合垫、步骤（3)得到的特定包 被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6_宽的细条，即得恶臭假 单胞菌检测试纸条，真空封装，4 °C保存。
4. 根据权利要求3所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述 的恶臭假单胞菌抗原的制备方法如下：取实验室_80°C保存的恶臭假单胞菌种，在LB固体 培养基中划线活化，28°C倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL LB液体培养基的试管 中，28°C，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用LB液体培养基按1 : 100稀释到三角烧瓶 中，28°C，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其0D600值，当其0D600值达到0. 4-0. 6时停止 培养。将培养的菌液在4°C进行5000rpm离心lOmin，弃上清，下层沉淀用pH 7. 2的0. 01M PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心lOmin，沉淀再次用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉 淀即为恶臭假单胞菌抗原。
5. 根据权利要求4所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述 的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法如下： (1) 抗恶臭假单胞菌卵黄抗体的制备 将上述恶臭假单胞菌抗原与无菌生理盐水混合得到恶臭假单胞菌悬液，加入甲醛使甲 醛体积终浓度达0. 5%，然后37°C恒温水浴灭活24h，即得到灭活的恶臭假单胞菌抗原；取 健康的初产蛋的母鸡作为免疫对象，将灭活恶臭假单胞菌抗原用生理盐水稀释后和弗氏完 全佐剂等体积混合，充分乳化后对母鸡的双翅、双腿、背部和胸肌部位肌肉注射进行基础免 疫，每只母鸡免疫剂量为4X 109CFU，15-20天后，将灭活的恶臭假单胞菌抗原和弗氏不完 全佐剂进行等体积混合，充分乳化后对母鸡肌肉注射进行加强免疫，每只母鸡免疫剂量为 2X 109CFU，加强免疫重复进行三次，每次间隔时间为7-10天，然后收集鸡蛋测定效价，当卵 黄抗体效价> 1 : 20000时收集鸡蛋，分离卵黄，用饱和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体； (2) 胶体金标记抗恶臭假单胞菌卵黄抗体 将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按6-8 y g :lmL混合，在pH 5. 4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST 缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm， 1-1. 5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含 lwt %牛血清白蛋白、2. 5wt %鹿糖、lwt %海藻糖，0? 02wt %叠氮化钠的pH 7. 2的0? 01M PBS缓冲液重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。
6. 根据权利要求5所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于用饱 和硫酸铵沉淀法纯化卵黄抗体的具体方法如下：称取适量步骤（1)分离得到的卵黄，按体 积比1 : 9加入pH 5. 0的0. 05M的乙酸-乙酸钠缓冲液，搅拌均匀后4°C静置过夜，8000g 离心20min，取上清液加入饱和硫酸铵至饱和度为40%，4°C搅拌6h，10000g离心20min，沉 淀用10-20倍卵黄质量的双蒸馏水重悬，加入饱和硫酸钠至饱和度为40%，4°C搅拌过夜， 10000g离心20min，沉淀用少量pH7. 2的0. 01M的PBS缓冲液重悬后，在PBS缓冲液中透析 即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体。
7. 根据权利要求5所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于步骤 (2)中胶体金制备方法如下：将100mL 0. Olwt%的氯金酸溶液，加热煮沸后，边搅拌边加入 l-2mL lwt%柠檬酸三钠迅速摇匀，继续加热，溶液由淡黄色变黑变红色，至颜色稳定后继 续加热5-10min，冷却后补足失水至100mL，无菌密封，4°C避光保存。
8. 根据权利要求5所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所 述的检测线距离所述的结合垫6-8mm ;所述的质控线距离所述的吸水垫6-8mm，所述的检测 线和所述的质控线的宽度分别为〇. 8-1_，两条线相距为5_。
9. 根据权利要求3所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所 述的恶臭假单胞菌超声波破碎液的包被量为1-2 U L/cm ;所述的兔抗鸡卵黄抗体的包被量 为1-2 y L/cm，所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液是将所述的恶臭假单胞菌抗原用PBS重 悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液。
【文档编号】G01N33/569GK104374914SQ201410657289
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】章礼平, 李登峰, 方静, 刘联国, 刘飞, 陈梅娟 申请人:宁波大学