一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用。本发明对恶臭假单胞菌XPSN进行基因改造，构建6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因失活的基因工程恶臭假单胞菌P-HSP。其构建方法包括步骤：引物设计、PCR扩增、构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB、将重组质粒转移入大肠杆菌S17-1、双亲杂交。本发明还将基因工程恶臭假单胞菌P-HSP作为生物催化剂应用于尼古丁转化反应生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶中。本发明中构建的基因工程菌株转化效率高，操作简便，菌株传代稳定，能够重复使用三次，降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。
【专利说明】—种基因工程恶臭假单胞菌及其构建方法与应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种基因工程恶臭假单胞菌，尤其涉及一种生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的基因工程恶臭假单胞菌的构建与应用。
【背景技术】
[0002]尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是烟草中的主要生物碱，占烟草干重的2~8 %。尼古丁属于N-杂环化合物，有很好的水溶性，能够非常容易的穿过生物膜和血脑屏障。1994年美国环保总局将尼古丁定义为“有毒的危险废弃物”。因此，从烟草废弃物中去除尼古丁或者将这些废弃物转化成有价值的化合物是十分必要的。微生物处理方法是建议的快速处理烟草废物的方法之一。很多微生物能够生长在烟叶及附近土壤中，并利用尼古丁作为唯一碳、氮源和能源。同时烟草加工会造成烟草废物的大量产生，这些废物含有以尼古丁为主的有毒物质，是一种“危险的有毒废物”，给我们的生存环境带来了极大威胁。此外，随着烟草使用被逐渐限制，开发烟草的其它用途也势在必行。
[0003]吡啶类化合物是一种自然环境中广泛存在的化合物，有很多吡啶类化合物具有重要的生物学活性，在医药等领域有重要的作用。但是多数吡啶类化合物是通过经典的有机化学合成进行生产。但是吡啶类化合物的有机合成途径往往伴随着副产物的生成，并且反应过程中使用到大量的有机溶剂，这些都会增加生产成本，并对环境造成污染。生物催化因为其具有反应温和，副 产物少，不使用有机溶剂等特点，可以降低生产成本，减少有机溶剂的使用。因此可以取代或者取代部分的有机合成的步骤参与化合物的合成。
[0004]6_羟基 _3_玻拍酸吡唳(6-hydroxy-3-succinoylpyridine, HSP)是尼古丁吡咯代谢途径中的一个重要的中间产物,也是一种潜在的重要的化工原料,例如可以作为生产重要药物地棘蛙素(epibatidine)的前体。6_羟基_3_琥珀酰吡啶可以作为前体生产2_位取代吡啶衍生物，2，5- 二位取代吡啶衍生物或者N-氧化吡啶衍生物，这些化合物往往是具有重要生物学活性的药物或者农药。
[0005]已经报道的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产都是通过尼古丁降解微生物转化实现的。1997年Roduit等人利用争论贪噬菌DSM8244野生型菌株以流加的方式发酵生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶，但是该技术反应时间长，发酵条件复杂不利于控制反应。ZL200510025598.0公开了经过优化的利用以争论贪噬菌DSM8244野生型菌株为代表的几株野生型菌株制备成的休止细胞进行6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产。例如:利用争论贪噬菌DSM8244野生型菌株休止细胞进行尼古丁转化反应，反应体系为7.5L，尼古丁初始浓度为7g/L，最终得到22.3g6-羟基-3-琥珀酰吡啶粉末，尼古丁转化率为35.3% (mol/mol)。但是目前已经报道或者公开的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法使用的催化剂均为野生型菌株，这些野生型菌株中天然存在有能够催化6-羟基-3-琥珀酰吡啶转化成其它化合物的酶，例如已发现的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶(HspB)会在催化反应中进一步降解6-羟基-3-琥珀酰吡啶，从而不可避免地造成产物6-羟基-3-琥珀酰吡啶的损失。为了获得纯度高，浓度高的6-羟基-3-琥珀酰吡啶，必须严格控制反应条件，这增加了反应控制难度和生产成本。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于开发一种转化效率高，操作简便，传代稳定的菌株用于6-羟基-3-琥珀酰吡啶的生产，并克服其在反应中进一步降解的问题。本发明构建的基因工程恶臭假单胞菌菌株(命名为P-HSP)能使6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶功能失活，阻断代谢途径，实现了 6-羟基-3-琥珀酰吡啶的积累，从而提高了转化率，转化实验易于控制，降低了反应成本，具有重要的工业应用价值。
[0007]本发明的技术方案如下:
[0008]1、基因工程恶臭假单胞菌P-HSP的构建方法，由以下步骤组成:
[0009](I)利用 PCR 技术，以恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) XPSN(CCTCCN0.M205038)基因组为模板，扩增得到命名为hspB (基因序列见序列表)的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因的部分基因片段；
[0010](2)利用内切酶分别对步骤⑴中得到的基因片段和PKlSmob质粒进行双酶切；优选地，双酶切使用的内切酶为EcoRI和BamHI。pK18mob质粒从大肠杆菌Transl-Tl中提取获得，该质粒可以在大肠杆菌中复制，但在恶臭假单胞菌中不能复制，为恶臭假单胞菌的自杀质粒；
[0011](3)将步骤⑵中双酶切后的基因片段和PKlSmob质粒用连接酶进行连接，构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB ;优选地，连接酶为T4DNA连接酶；
[0012](4)将步骤(3)中得到的敲除用重组质粒pK18mob_hspB转化入大肠杆菌S17-1中，作为双亲杂交的供体菌株；
[0013](5)选用恶臭假单胞菌XPSN作为受体菌株培养，将其与步骤(4)中得到的供体菌株进行双亲杂交，经过筛选和验证后获得基因工程恶臭假单胞菌，命名为P-HSP。
[0014]进一步，步骤(1)中的扩增使用上游引物PH-F:5/ -ccggaattcggggacaaatgtggtggtg-3'，下游弓丨物 PH-R5' -cgcggaatcccaagaactacccgaacaga-3'。
[0015]进一步，步骤(5)所述验证为PCR扩增验证，使用的引物为:上游引物mob-F:5' -cggctcgtataatgtgtgga-3'，下游弓丨物 hspB-RS' -ctacagaaaggtttccatagt-3'。
[0016]2、提供一种基因工程恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida) P-HSP,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2014135，保藏日期为:2014年4月20日，保藏单位地址:中国武汉武汉大学,分类命名:恶臭假单胞菌Pseudomonas putida。
[0017]3、提供一种利用基因工程菌株恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基_3_琥珀酰吡啶的方法，以尼古丁为底物，以基因工程恶臭假单胞菌P-HSP为生物催化剂。
[0018]进一步，由以下步骤组成:
[0019](I)斜面培养:将基因工程恶臭假单胞菌P-HSP接种到固体培养基斜面上，28-32°C培养 11-13 小时；
[0020](2)种子培养:将步骤(1)培养的菌株，接种到含有卡那霉素的液体培养基中，28-32°C过夜培养，制得种子；优选地，卡那霉素的浓度为50μ g/mL ；
[0021](3)制备休止细胞:将步骤(2)中得到的种子接种到同时含有卡那霉素和尼古丁的液体培养基中，28-32°C培养9-11小时，然后离心，收集菌体，并用0.9% NaCl洗涤一次，再用蒸馏水重悬菌体沉淀，即为恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞，4°C储存备用；优选地，卡那霉素的浓度为50μ g/mL,尼古丁的浓度为lg/L,离心转速为5000转/分钟,离心时间为10分钟，用蒸懼水重悬菌体沉淀至3.4g/L细胞干重(dry cell weight, DCff)；
[0022](4)转化反应:在恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞中加入尼古丁，调节pH至9.0,在28-32°C、110-130转/分钟的条件下振荡反应，然后终止转化反应，恶臭假单胞菌菌株P-HSP休止细胞可以分批反应，或补料分批连续转化反应。
[0023](5)生物催化剂的分离:将步骤(4)终止反应后的混合物离心，分离沉淀，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的上清液；优选地，离心转速为5000转/分钟，离心时间为15分钟；
[0024](6)样品浓缩:将步骤(5)中分离的上清液进行蒸馏，制得浓缩液。优选地，所述蒸馏在真空度0.08Mpa、70°C的条件下进行，浓缩也的体积是上清液体积的1/20 ；
[0025](7) 6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取:将步骤(6)中制得的浓缩液用盐酸调节pH至
2.5以下，室温静置1.5-2.5小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀，然后去除上清，再用盐酸溶液洗涤沉淀，最后干燥所述沉淀，得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。优选地，采用抽滤的方法去除上清，用2mol/L的盐酸溶液洗涤沉淀，并在60°C干燥箱中干燥该沉淀8小时。
[0026]进一步，步骤(4)中分批反应时加入尼古丁的终浓度为6g/L，反应时间为5小时。 [0027]进一步，生物催化剂重复使用:将步骤(5)中的沉淀用蒸馏水重悬后，重新制得恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞后，并重复步骤(4)至(5)。
[0028]进一步，上述重复为一次或两次，第一次重复时，加入的尼古丁的终浓度为4g/L，反应时间为5小时，第二次重复时，加入的尼古丁终浓度为4g/L，反应时间为6小时。
[0029]进一步，可采取补料分批连续转化反应的方式进行生产:将步骤(4)制备的休止细胞中加入终浓度为6g/L的尼古丁，分别在转化开始后5小时、10小时和17小时补充4g/L尼古丁，23小时后终止转化反应。补料分批生产的催化剂不再进行重复使用。
[0030]样品检测:将步骤(7)制得的6-羟基-3-琥珀酰吡啶粉末，用HPLC、LC-ES1-MS,13C NMR和1H NMR检测样品的纯度和结构。
[0031]本发明对于转化率和生产速率的定义如下:
[0032]6-羟基-3-琥珀酰吡啶转化率定义为(mo I/ 6 —藝基—3 —5?(ιποΙ)
mo I) --*:它古丁.:考耗鐵S(IHOl)
[0033]6-羟基-3-琥珀酰吡啶生产速率定义为(g/L/h)为:
6 —巧基―3_^;3g^f(g/L):UMAm (id0
[0034]本发明中构建的基因工程菌株转化效率高，操作简便，菌株传代稳定，能够重复使用三次。以尼古丁为底物，利用补料分批连续转化的方法，6-羟基-3-琥珀酰吡啶的最高产量为16.3g/L，对应的反应周期仅为23小时，生产速率为0.71g/L/h，转化率为75% (moI/mol) ο【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1是本发明实施例1中检测尼古丁转化结果的HPLC图谱，其中实线和虚线分别代表反应进行O小时(尼古丁峰)和5小时(6-羟基-3-琥珀酰吡啶峰)的样品。
[0036]图2是本发明实施例2补料分批连续反应中尼古丁和6-羟基-3-琥珀酰吡啶的浓度随时间的变化图。
[0037]图3是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的LC-ES1-MS检测图谱。
[0038]图4是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的1H NMR图谱。
[0039]图5是本发明实施例1中6-羟基-3-琥珀酰吡啶的13C NMR图谱。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0041]实施例1
[0042]构建hspB基因敲除质粒pK18mob_hspB:
[0043]本实施例中所用的菌株为恶臭假单胞菌XPSN(CCTCC N0.M205038)。
[0044]本实施例中所用的培养基的组成如下:
[0045]LB液体培养基:酵母提取物5g/L，NaC110g/L，胰蛋白胨10g/L，pH7.0。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌12rC,20min。
[0046]LB固体培养基:LB液体培养基中加入1.5% (w/v)琼脂粉。在使用前进行高温高压蒸汽灭菌121°C,20min。
[0047](I)扩增6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因(hspB)片段:
[0048]利用恶臭假单胞菌XPSN基因组为模板，根据《分子克隆实验指南(第三版)》中描述的方法进行PCR扩增。
[0049]PCR扩增引物:上游引物PH-F:5/ -ccgGMTTCggggacaaatgtggtggtg-3',下游引物PH-R5' -cgcGGATCCcaagaactacccgaacaga-3'。其中下划线所标示的碱基序列分别是EcoRI和BamHI的酶切位点。
[0050]PCR反应体系如下:
[0051]
【权利要求】
1.一种基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)利用PCR技术，以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)XPSN(保藏编号为CCTCCN0.M205038)基因组为模板，扩增得到命名为hspB的6-羟基-3-琥珀酰吡啶3-羟化酶基因的部分基因片段； (2)利用内切酶分别对步骤(1)中得到的基因片段和PKlSmob质粒进行双酶切； (3)将步骤(2)中双酶切后的所述基因片段和所述PKlSmob质粒用连接酶进行连接，构建敲除用重组质粒pK18mob-hspB ； (4)将步骤(3)中得到的所述敲除用重组质粒pKlSmob-hspB转化入大肠杆菌S17-1中，作为双亲杂交的供体菌株； (5)选用恶臭假单胞菌XPSN作为受体菌株培养，将其与步骤(4)中得到的供体菌株进行双亲杂交，经过筛选和验证后获得基因工程恶臭假单胞菌，命名为P-HSP。
2.根据权利要求1所述的基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增使用上游引物 PH-F:5/ -ccggaattcggggacaaatgtggtggtg-3',下游引物 PH-R5'-cgcggaatcccaagaactacccgaacaga-3'。
3.根据权利要求1所述的基因工程恶臭假单胞菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(5)中的验证为PCR扩增验证，使用的引物为:上游引物为mob-F:5' -cggctcgtataatgtgtgga-3'，下游引物为 hspB-RS' -ctacagaaaggtttccatagt-3'。
4.一种根据权利要求1所述的构建方法构建的基因工程恶臭假单胞菌P-HSP，保藏编号为CCTCC M2014135，保藏于中国典型培养物保藏中心。
5.一种利用基因工程恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于以尼古丁为底物，以基因工程恶臭假单胞菌P-HSP为生物催化剂。
6.根据权利要求5所述的利用基因工程恶臭假单胞菌P-HSP生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)斜面培养:将所述基因工程恶臭假单胞菌P-HSP接种到固体培养基斜面上，28-32°C培养 11-13 小时； (2)种子培养:将步骤(1)培养的菌株，接种到含有卡那霉素的液体培养基中，28-32°C过夜培养，制得种子； (3)制备休止细胞:将步骤(2)中得到的所述种子接种到同时含有卡那霉素和尼古丁的液体培养基中，28-32°C培养9-11小时，然后离心，收集菌体，并用0.9% NaCl洗涤一次，再用蒸馏水重悬菌体沉淀，即为恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞，4°C储存备用； (4)转化反应:在所述恶臭假单胞菌P-HSP休止细胞中加入尼古丁，调节pH至9.0，在28-32°C、110-130转/分钟的条件下振荡反应，然后终止转化反应，所述恶臭假单胞菌菌株P-HSP休止细胞可以分批反应，或补料分批连续转化反应； (5)生物催化剂的分离:将步骤(4)终止转化反应后的混合液离心，分离沉淀，即得到含有6-羟基-3-琥珀酰吡啶的上清液； (6)样品浓缩:将步骤(5)中分离得到所述上清液进行蒸馏，制得浓缩液； (7)6-羟基-3-琥珀酰吡啶的提取:将步骤(6)中制得的所述浓缩液用盐酸调节pH至.2.5以下，室温静置1.5-2.5小时，使6-羟基-3-琥珀酰吡啶充分沉淀，然后去除上清，再用盐酸溶液洗涤得到的沉淀，最后干燥所述沉淀，得到的粉末即为6-羟基-3-琥珀酰吡啶。
7.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步骤(4)中分批反应时加入尼古丁的初始浓度为6g/L，反应时间为5小时。
8.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于所述步骤(4)中补料分批连续转化反应中先加入尼古丁的初始浓度为6g/L，然后分别在转化开始后5小时、10小时和17小时补充终浓度为4g/L的尼古丁，23小时后终止转化反应。
9.根据权利要求6所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述生物催化剂重复使用，将所述步骤(5)中的所述沉淀用蒸馏水重悬，重新制得基因工程恶臭假单胞菌P-HSP的休止细胞，并重复步骤(4)至(5)。
10.根据权利要求9所述的生产6-羟基-3-琥珀酰吡啶的方法，其特征在于，所述重复为一次或两次，第一次重复时，加入的尼古丁的终浓度为4g/L,反应时间为5小时,第二次重复时，加入的尼古丁终浓度为4g/L，反应时间为6小时。
【文档编号】C12R1/40GK103952429SQ201410180577
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月30日 优先权日:2014年4月30日
【发明者】许平, 于浩, 唐鸿志, 马翠卿 申请人:上海交通大学