一种来源于恶臭假单胞菌的epsp合酶基因及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对草甘膦具有高抗性的来源于恶臭假单胞菌的EPSP合酶基因及其在转基因植物中的应用。本发明所提供的将该基因转化植物的方法和其在转基因植株中表现的高抗草甘膦活性，将在抗草甘膦植物的研究和开发中发挥重要作用。
【专利说明】—种来源于恶臭假单胞菌的EPSP合酶基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物基因工程领域和植物遗传工程学领域，具体涉及一种来源于恶臭假单胞菌的EPSP合酶基因及其在转基因植物中的应用。
【背景技术】
[0002]草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)是一种有机磷除草剂。20 世纪70年代初由孟山都公司开发，通常使用时一般将其制成异丙胺盐或钠盐。其异丙胺盐是著名除草剂商标“Roundup”的活性成分。
[0003]草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，是全世界使用量最大的除草剂之一。草甘膦的除草性能优异，极易被植物叶片吸收并传导至植物全身，对一年生及多年生杂草都有很高的活性。但是该除草剂是一种非选择性除草剂，对农作物同样具备杀伤力。为使在农作物生产中更广泛的使用草甘膦，必须培育出具有抗草甘膦抗性或降解性的农作物。
[0004]草甘膦的毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5_enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS,简称 EPSP 合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等生物合成过程中的一个关键酶。草甘膦可以通过植物的韧皮部进行运输，并与EPSP合成酶结合，从而阻断芳香族氨基酸的生物合成，引起细胞死亡。
[0005]草甘膦也能抑制大部分细菌中芳香族氨基酸的生物合成中EPSP合成酶活性，但是部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被克隆获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。例如农杆菌(Agrobacterium tumefacienssp CP4)和typhimurium CT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用(美国专利453590，47 69061，5094945)。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的抗草甘膦转基因植物。
[0006]我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无抗草甘膦转基因作物进入商品化阶段的报道。因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的EPSPS，从而获得抗草甘膦转基因植物。
[0007]本发明从污泥中筛选到一株具有草甘膦抗性的细菌，利用其基因组序列的信息克隆了其EPSPS基因，并且进一步在拟南芥、玉米、水稻、棉花、大豆等植物中证明了这个EPSPS基因的抗草甘膦能力及其在发展转基因抗草甘膦农作物中的用途。
【发明内容】
[0008]本发明所要解决的技术问题在于提供新的使植物具有草甘膦抗性的基因及其编码蛋白。另外，本发明还提供了这个基因的基因工程中间体(如，表达盒、载体和细胞等)，获得具有草甘膦抗性的植物的方法和应用，并提供了判断植物是否具有草甘膦抗性的鉴定方法。
[0009]具体而言，在第一方面，本发明提供了一种对草甘膦具有高抗性的新基因，本发明所提供的草甘膦抗性基因，是发明人筛选并克隆到的一种新的EPSP合酶基因(以下称为P-EPSP合酶基因)。P-EPSP合成酶基因是用PCR方法从发明人筛选的高草甘膦抗性菌株恶臭假单胞菌putida ) KT-CGL_7_6 中克隆得到的。putidaKT-CGL-7-6为本发明人从喷洒草甘膦的试验田土壤中经初筛和复筛等大量的实验得到的对草甘膦具有高耐受活性的菌株。菌株KT-CGL-7-6于2013年I月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.7190，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。P-EPSP合酶基因是下述核苷酸序列之一:
1)序列表中SEQID NO:I所不的核昔酸序列；
2)与SEQID NO:1序列具有90%以上相似性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
3)与SEQID NO:1相比，具有SEQ ID NO:1序列的部分、区段和/或片段(包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物且可编码赋予高草甘膦抗性活性的蛋白质的核苷酸序列；
4)根据SEQID NO:1，利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码高草甘膦抗性活性的蛋白质多肽；
5)通过导入SEQI D NO:1所示的核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗草甘膦能力的蛋白质的核苷酸序列。
[0010]本发明第一方面的草甘膦抗性基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于:1)利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；2)通过导入核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗草甘膦能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失的变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变
B1升。
[0011]在第二方面，本发明提供对草甘膦具有高抗性的一种新的EPSP合成酶基因的编码蛋白，由本发明第一方面的基因编码，该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
(1)由SEQID No:2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，
(2)与SEQID No:2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予高草甘膦抗性活性的蛋白质；
(3)与SEQID No:2代表的蛋白序列相比，有具有SEQ ID No:2序列的部分、区段和/或片段(包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物且赋予高草甘膦抗性活性的蛋白。
[0012]在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码如SEQ ID No:2所示的蛋白的核酸分子或其片段。另外，可通过如定点诱变技术等合成与突变体具有相同功能的本发明的突变体基因。
[0013]当然，本领域技术人员根据本文的启示，通过缺失、取代和/或添加SEQ ID No:2所示的蛋白中一个或几个氨基酸的方式，或者通过杂交来搜寻能在严紧条件下能与编码SEQ ID No:2所示的蛋白的核酸杂交的核酸，选择出与本发明的基因功能等同的突变体蛋白及其基因，这也纳入本发明的范围之内。
[0014]本发明的基因可以与其他基因和蛋白质融合以产生嵌合或融合蛋白。本发明的有用基因和蛋白质不仅包括具体的示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段和/或片段(包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失)、其变体、突变体、嵌合体和融合物。
[0015]只要保留所需的功能活性，本发明的蛋白质可以具有替换的氨基酸。保留了如示例蛋白质相应片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等价物在本发明的范围内。
[0016]通过改变蛋白质三维特征和其他未提及的多种特性(例如保守型氨基酸替换)而不对蛋白质的活性/功能性产生不利影响，这些也在本发明的范围内。
[0017]通过各种方法，例如通过多种蛋白酶进行切割，而切除蛋白质的部分序列，并在切除后仍保留并表现活性和功能，由这种方法产生的蛋白质也在本发明的范围内。
[0018]用于植物表达的序列优化也在本发明范围内。为了在植物中更好的高表达外源基因，可能优选重新设计所述基因以使其在植物细胞中更有效的表达。例如可以利用植物密码子偏好性重新改造外源基因以得到最优表达。
[0019]本发明的P-EPSP合成酶基因及其编码蛋白赋予微生物对草甘膦的高耐受活性，其最大耐受浓度达到6500 mg/L,而同时作为对照的的农杆菌
AgLO对草甘膦的最大耐受浓度只有3000 mg/L。
[0020]在第三方面，本发明`提供了包含本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的载体。本文中的术语“载体”是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同，“载体”在本文中可以分为“克隆载体”、“表达载体”和“转化载体”，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中适用的载体包括但不限于:在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物表达载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。除了在克隆过程中必要的克隆载体之外，还优选本发明第四方面中的载体是转化载体，尤其是植物转化载体，特别是适合农杆菌转化植物的载体。上述重组载体还包含外源基因或外源DNA片段。
[0021]在第四方面，本发明提供了包含本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的细胞。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。优选的细胞可以是农杆菌细胞，利用它可以将目的基因转化入植物。另外优选的是微生物细胞，如细菌细胞，它们可以作为克隆载体或转化载体的宿主细胞。
[0022]在第五方面，本发明提供了植物，其包含本发明第一方面的P-EPSP合酶基因，和/或其表达本发明第二方面的蛋白质。由于引入了本发明第一方面的P-EPSP合酶基因和本发明第二方面的蛋白质，本发明第五方面的植物具有草甘膦抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代，也包括后代的转基因植物细胞、组织、器官、种子。[0023]本发明第五方面的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。优选的植物和植物细胞为拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等。还可以根据本发明产生其他类型的转基因植物，如水果、蔬菜和树木。可以将本发明的蛋白质编码基因引入多种微生物或植物宿主中。本发明包括转基因植物细胞和转基因植物。
[0024]在第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的基因在获得具有草甘膦抗性的转基因植物过程中的应用。在已知基因的条件下，培育转基因植物的方法是有先例的，例如可以通过农杆菌转化的方式或者微粒轰击或电穿孔的方式将基因导入植物或其组织中，然后培养该植物或其组织并在存在草甘膦的环境中筛选。优选在本文中，所述植物是拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等。
[0025]在本文中，获得包括制备、培育、生产或以其他方式产生得到，包括通过转基因育种方式获得，如将本发明第一方面的基因转入植物后使之表达本发明第二方面的蛋白质；也包括通过非转基因育种方式获得，如通过杂交、回交、自交或无性繁殖本发明第五方面的植物并分选出仍旧包含本发明第一方面的基因并表达本发明第二方面的蛋白质的植物。因此，本发明的第六方面提供的应用包括，在获得具有草甘膦抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有草甘膦抗性的非转基因植物过程中的应用。
[0026]在第七方面，本发明提供了获得具有草甘膦抗性的植物的方法，其包括如下步骤:
(1)使植物包含本发明第一方面的基因；和/或，
(2)使植物表达本发明第二方面的蛋白质。
[0027]可以采用前述或者本领域技术人员能获知的转基因和非转基因方法，使植物包含本发明第一方面的基因，或者使植物表达本发明第二方面的蛋白质。实施本发明第七方面的方法，能够获得本发明第五方面的植物。优选在本发明的第七方面中，可以采用的步骤包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。这些步骤本身对于转基因或非转基因育种领域的技术人员来说，都是可以获知并实施的。
[0028]在第八方面，本发明提供了鉴定本发明第五方面的植物或者本发明第七方面的方法获得的植物的方法，其包括如下步骤:
(1)测定所述植物是否包含本发明第一方面的基因；和/或，
(2)测定所述植物是否表达本发明第二方面的蛋白质。
[0029]测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出基因或其编码蛋白的方法都可以。示例性的方法包括蛋白质测序、核酸测序、聚合酶链式反应(PCR)检测、探针杂交检测等。
[0030]如从所述转基因植物或其后代、种子中进行本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因或其同源序列的扩增，对扩增出的序列进行序列分析并与本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因序列相比较。其中扩增的方法是公知的，如PCR扩增。由于本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因是从细菌中分离得到的，天然的植物或其种子中并不含有该基因，如果能够从植物或其种子中扩增出序列而且该序列与本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因相同，那么该植物或其种子就是导入了本发明第一方面所述的P-EPSP合酶基因的草甘膦抗性的转基因植物或其后代、种子。
[0031]本发明涉及来自转基因植物的转基因植物细胞、组织、器官、种子或植物体部分。本发明也包括转基因植物后代及后代的转基因植物细胞、组织、器官、种子和植物部分。
[0032]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]序列表1为从PsmdoiBoims putida KT-CGL_7_6扩增获得的草甘膦抗性基因P-EPSP合酶基因的核苷酸序列。
[0034]序列表2为从PsmdoiBoims pu tida KT-CGL_7_6扩增获得的草甘膦抗性基因P-EPSP合酶基因的氨基酸序列。
[0035]图1为载体PTGl的结构示意图。
[0036]图2为植物表达载体PTG2-PEPSP的结构示意图。
[0037]图3为Tl代转基因拟南芥苗喷洒草甘膦实验。左图为喷洒草甘膦前转基因拟南芥苗生长情况；右图为喷洒2.5mM草甘膦两周后存活情况，野生型及未转基因苗枯死，阳性对照及转P-EPSP合酶基因苗存活。
[0038]图4为PCR检测转基因拟南芥Tl代电泳图，M为marker，l — 7为转基因拟南芥，一为阴性对照，+为阳性对照。
[0039]图5为T1代转基因玉米苗生长30`天后，喷洒20mM的草甘膦，经过一周后存活情况，非转基因玉米已经干枯(B)，转基因玉米未受影响(A)。
[0040]图6为T1代转基因大豆苗生长30天后，喷洒20mM的草甘膦，经过一周后存活情况，非转基因大豆无法正常生长(B)，转基因大豆生长良好(A)。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中的溶剂均为水，具体步骤可参见:((Molecular Cloning: A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell, David ff.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edition,200I,NY,Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。
[0042]1780 改培养基(1L) =K2HPO4 0.61g, KH2PO4 0.39g, KCl 0.25g, MgSO4.7H20 0.13g,微量元素液1.0ml。灭菌冷却后添加草甘膦至所需终浓度。
[0043]其中每1000rnl 微量元素液包括 CaCl2.2H20 0.0004g, FeSO4.7H20 0.04g,MnSO4.4H20 0.04g, ZnSO4.7H20 0.02g, CuSO4.5H20 0.005g, CoCl2.6H20 0.004g, NaCl1.0g, Na2MoO4.2H20 0.005g。
[0044]1/10LB液体培养基(IL):酵母粉0.5g，蛋白胨lg，NaCl IOg ;灭菌冷却后添加草甘膦至所需终浓度。[0045]LB液体培养基(IL):蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOgo
[0046]2XYT培养基(IL):酵母提取物 16g，蛋白胨 16g，NaCl 5 g，琼脂粉12g。
[0047]如需要，在以上培养基中添加相应的抗生素。卡那霉素终浓度5(^g/ml，利福平终浓度40μ〖/ηι1。
[0048]实施例1
草甘膦抗性菌株put?da KT-CGL_7_6的分离、纯化和鉴定 1、土壤样品来源
从喷洒草甘膦的实验田土层下5cm处采集土壤样品。
[0049]2、草甘膦抗性菌株的分离、纯化
菌株的富集:分别称取20克土壤样品，其中一份土壤样品加入到含100mg/L草甘膦的1/10LB液体培养基中(装液量为50ml/300ml三角瓶)，另一份土壤样品加入到含100mg/L草甘膦的1780改液体培养基中(装液量为50ml/300ml三角瓶)，置30°C摇床中200rpm进行富集培养。
[0050]菌株的驯化与纯化:每次富集培养7天,将培养物3000rpm离心IOmin,弃上清,沉淀中重新加入培养基，继续驯化。驯化四个周期后，开始逐步提高培养基中草甘膦浓度(草甘勝浓度梯度为:200mg/L, 300mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L, 800 mg/L, 900 mg/L, lOOOmg/L和1200mg/L)，7天为一个驯化周期，并同时在每个驯化周期结束时取培养液在1780改固体平板上涂布，30°C恒温培养，挑取单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。其中，在草甘膦驯化浓度为750mg/L时筛选到本`发明的菌株KT-CGL-7-6。
[0051]3、草甘膦耐受实验:
在草甘膦抗性菌株筛选过程中共分离到52株抗性菌株，分别对它们进行了草甘膦耐受实验，并以农杆菌(Agrobacterium tumefaciens ) AgLO为阴性对照。草甘膦耐受浓度梯度分别为(mg/L):100、200、500、1000、1200、3000、5000、5500、6000、6500 和 7000，耐受培养基为LB液体培养基，置30°C摇床中200rpm培养三天，测定培养液的OD6tltl。结果:可以耐受5000mg/L草甘膦浓度的抗性菌有6株,其中的两株可以最高耐受6500mg/L的草甘膦,其中本发明的KT-CGL-7-6可以耐受草甘膦的浓度最高为6500mg/L，而农杆菌AgLO对草甘膦的最大耐受浓度只有3000 mg/L。
[0052]4、草甘膦抗性菌株KT-CGL-7-6总DNA的提取及菌种鉴定
将分离获得的KT-CGL-7-6在3ml液体LB培养基中培养16h，用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取菌体总DNA。
[0053]以提取的总DNA为模板，利用细菌16SrRNA通用弓丨物27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R (GGTTACCTTGTTACGACTT)扩增抗性菌株16SrRNA基因。PCR产物1%琼脂糖凝胶回收后连接PEASYBlunt载体，转化DH5ci，挑取阳性克隆送至英骏公司测序。测序结果在NCBI中进行序列比对,结果显示KT-CGL-7-6为恶臭假单胞菌i^Pseudomorms putida),所以命名为 Pseudoinonas putida KT-CGL-7-6?
[0054]实施例2
高耐受草甘膦的DNA片段克隆
1、PCR方法获得部分高耐受草甘膦的DNA片段根据NCBI中公布的Pseudomorms putida的EPSP合酶基因序列设计引物。
[0055]引物1-F:5' - CGG GATCCGTGGTAAATGCAGCAAAAACCAAACC-3'
引物 1-RA' - CCCA AGCTTGGACACGACTTGCCCTCTTCTGCCACG -3'
用高保真Taq酶KOD-FX从A putida KT-CGL_7_6基因组中扩增EPSP合酶基因的部分序列，PCR 程序:98°C 10 sec,60°C 30 sec,68°C 2min，共 30 个循环。
[0056]结果获得PCR产物共2241bp，命名为P-EPSP合酶基因。P-EPSP合酶基因有2241个核苷酸组成，如SEQ ID No:1所示；P_EPSP合酶基因编码的蛋白质由746个氨基酸组成，如SEQ ID No:2所示。引物1-F的序列如SEQ ID No:3所示；引物1-R的序列如SEQ IDNo:4所示.实施例3植物表达载体PTG2-PEPSP的构建 1、PTGl载体的构建过程
取载体pCAMBIA2300，通过SacII和BstXI酶切连接，将LB-LB-MAR结构插入PCAMBIA2300,构建成 pCAMBIA2300_DLB_MAR，再通过 BamHI 和 PmeI 酶切连接，将另一个 MAR构建入PCAMBIA2300-DLB-MAR，得到pTG_ori。通过SpeI和HinIII酶切连接过程，将FMVEnhancer增强子构建入pTG-or1-FMV,再经过SalI和HinIII酶切，链接AtEfl-a pro结构，得到 pTG-or1-FMV-Ef la，最后将 pTG-or1-FMV-Ef Ia 经过 XmaI 和 EcoRI 酶切，连接 T-E9片段得到载体PTGl (载体PTGl结构示意图如附图1所示)。
[0057]2、根据P-EPSP合酶基因序列设计引物2_F和2-R 引物 2-F: TCATGAGTGGTAAATGCAGCAAAAACC
引物 2-R: ACCGGTTCA CGACTTGCCCTCTTCTG
用引物2-F (SEQ ID No:5所示)和引物2-R (SEQ ID No:6所示)对P-EPSP合酶基因序列进行PCR扩增，然后用BspH I和Age I酶切，得到插入片段；取PTGl载体(PTG1载体的结构示意图为图1所示)用BspH I和Age I酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2 X YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序选择序列正确的克隆，得具有目标基因的质粒，命名为PTG2-PEPSP，结构示意图见附图2。
[0058]实施例4:植物转化、苗期筛选
植物转化:将构建好的植物表达载体转化农杆菌AgLtl,用于转化植(作)物:拟南芥、烟草、水稻、玉米、棉花、大豆、小麦、油菜、草坪草以及牧草等。通过农杆菌液浸花法转化拟南芥和玉米；通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草；通过农杆菌介导的纵切幼苗茎尖法转化棉花；通过农杆菌侵染愈伤后分化再生获得转基因水稻；通过农杆菌介导的子叶节组织再生转化法获得转基因大豆。
[0059]转化拟南芥结果如下:
Tl代拟南芥苗筛选:含有重组载体的农杆菌转化拟南芥，收获TO代种子并播种，在其长出4片叶时喷洒2.5mM的草甘膦。两周后，未转基因的拟南芥苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好，结果见附图3。
[0060]根据P-EPSP合酶基因序列设计基因检测引物3-F和3-R，用来检测P-EPSP序列中的1500bp基因片段。
[0061]引物3-F: GAAGGGGACGGGCACCAGCTGCTGG弓丨物 3-R:TGGTGTGTGCGCAATGAAACTGATGCAT
用引物3-F和3-R PCR进一步在分子水平验证转基因株系的阳性。每株取两片嫩叶，用CTAB法提取植物基因组DNA。分别利用引物3-F (SEQ ID No:7所示)和3-R (SEQ ID No:8所示)，以抗性植株基因组DNA模板，扩增P-EPSP合酶基因片段。对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到1500bp的目的片段(结果见附图4)。我们对7个株系进行了 PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的拟南芥植株为具有草甘膦抗性的转基因阳性株系。
[0062]转化烟草的结果如下:
TO代烟草苗的筛选阶段:含有重组载体的农杆菌转化烟草，收获TO代种子并播种，在其长出4-5片幼叶时喷洒2.5mM的草甘膦。7天后，未转基因的烟草苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好。
[0063]转基因烟草植株Ttl代的分子检测:
取经过初步筛选得到的转基因烟草植株Ttl代叶片，提取基因组DNA，以引物3-F和引物3-R进行PCR检测，扩得大小为1500bp的P- EPSP合酶基因，结果86%以上为阳性，最终筛选出的阳性烟草Ttl代植株15株。
[0064]i代烟草植株抗性筛选:
对获得的T1代烟草15个株系进行草甘膦抗性实验，首先将烟草种子约每100粒种植在实验箱的一块区 段上，待长出幼叶4 - 5叶约30天时，对幼苗喷洒一定浓度的草甘膦。
[0065]用浓度为2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦喷洒幼苗，加野生型作为阴性对照，结果发现2.5mM的条件下处理5d后野生型全部枯死，转基因样品均未见明显损伤；而20mM的条件下，野生型处理2d后就已全部枯死，仍有有大量转基因烟草植株生长良好，表现出很好的草甘膦抗性。由此可见，转P-EPSP合成酶基因的烟草部分株系表现出了很好的草甘膦耐受性，该基因在烟草中实现了很好的表达。
[0066]转化棉花结果如下:
TO代转基因棉花苗的筛选:重组载体转化植物棉花，用潮霉素抗性筛选Ttl代转基因棉花，从转基因苗中提取基因组DNA用引物3-F和3-R进行PCR分子检测，从阳性Ttl代转基因棉花植株中收获T1代种子。
[0067]?代棉花株系的抗性筛选:
T1代棉花株系的筛选:播种Tl代种子，待株系长到4-5叶期时，喷洒草甘膦筛选抗性苗。喷洒的草甘膦实验浓度有2.5mM、5mM、10mM和20mM。结果发现:2.5mM时野生型棉花枯萎，转基因棉花生长良好。当草甘膦浓度达到20mM时，转基因棉花仍表现出很好的抗草甘勝能力。
[0068]从抗性结果可以得出:转P-EPSP基因的棉花部分株系表现出了很好的草甘膦耐受性，该基因在棉花中实现了很好的表达。
[0069]转化水稻结果如下:
水稻组培苗的筛选阶段:对重组载体转化植物水稻，用潮霉素抗性筛选Ttl代转基因水稻苗，从转基因苗中提取基因组DNA用引物3-F和3-R进行PCR分子检测，结果阳性检出率为90%以上。取阳性Ttl代转基因水稻苗，收获T1代种子。
[0070]?代水稻株系的抗性筛选:Tl代水稻长出4片叶时分别喷洒2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦。7天后获得生长良好的转基因Tl代。结果发现:2.5mM时野生型水稻枯萎，转基因水稻生长良好。当草甘膦浓度达到20mM时，仍有部分株系的植株具有抗草甘膦能力，转基因水稻的抗性苗与敏感苗比例超过2。从上面的结果可以看出:转PEPSP合酶基因水稻部分株系也表现出了很好的草甘膦耐受性，该基因在水稻中实现了很好的表达。
[0071]转化玉米结果如下:
Tl代转基因玉米筛选:含有重组载体的农杆菌转化玉米纯合亲本，收获TO代种子并播种，在其长出4片叶时喷洒2.5mM、5mM、10mM和20mM的草甘膦。7天后，未转基因的玉米苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好。结果发现:2.5mM时野生型玉米枯萎，转基因玉米生长良好。当草甘膦浓度达到20mM时，仍有部分株系的转基因玉米的抗性苗与敏感苗比例超过2，转基因玉米植株表现出很好的抗草甘膦能力(见附图5)，共获得高抗玉米株系共11株。
[0072]从上面的结果可以看出:转P-EPSP合酶基因玉米部分株系也表现出了很好的草甘膦耐受性，该基因在玉米中实现了很好的表达。
[0073]转化大豆结果如下:
大豆组培苗筛选:重组载体转化粮食作物大豆，直接用草甘膦作为筛选剂在培养基上成苗。Tl代直接扩繁不筛选，一粒种子成苗算一个株系单株收种，T2代喷洒草甘膦直接筛选抗性株系，草甘膦浓度为2.5mM、5mM、10mM和20mM。
[0074]结果发现:2.5mM时野生型大豆枯萎，转基因大豆生长良好。当草甘膦浓度达到20mM时，转P-EPSP合酶基因的大豆植株仍然表现出很好的抗草甘膦能力(见附图6 )。从转基因苗叶片中提取基因组DNA用引物3-F和引物3-R进行PCR分子检测，结果抗性植株均为转基因阳性苗。
[0075]从上面的结果可以看出:转P-EPS`P合酶基因大豆部分株系也表现出了很好的草甘膦耐受性，该基因在大豆中实现了很好的表达。
[0076]最后，还需要强调的是，以上举例的仅是本发明其中的几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.使植物具有草甘膦抗性的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.权利要求1所述的基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:2所示。
3.使植物具有草甘膦抗性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所示。
4.表达盒、载体或细胞，其包含权利要求1-2所述的基因。
5.权利要求1-2所述的基因、权利要求3所述的蛋白质、权利要求4所述的表达盒、载体或细胞、包含权利要求1-2所述的基因的植物、或表达权利要求3所述的蛋白质的植物在获得具有除草剂抗性的植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其包括在获得具有草甘膦抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有草甘膦抗性的非转基因植物过程中的应用。
7.根据权利要求5-6所述的应用，其特征在于，通过转基因育种方式或者非转基因育种方式获得具有草甘膦抗性的植物。
8.获得具有草甘膦抗性的植物的方法，其包括如下步骤: (O使植物包含权利要求1- 2所述的基因；和/或， (2)使植物表达权利要求3所述的蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。
10.鉴定植物的方法，其中植物包含权利要求权利要求1或2所述的基因的植物、表达权利要求3所述的蛋白质的植物或者权利要求8或9所述的方法获得的植物，其包括如下步骤: (1)测定所述植物是否包含权利要求1或2所述的基因；和/或， (2)测定所述植物是否表达权利要求3所述的蛋白质。
11.根据权利要求ι-?ο任一项所述，其特征在于:所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，其中单子叶植物为水稻、玉米、小麦，双子叶植物为拟南芥、烟草、棉花、大豆。
【文档编号】C12N9/10GK103695446SQ201310737930
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年1月31日
【发明者】夏勉, 徐海英, 徐沫文, 张斌 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司