转基因动物的制备方法
【专利摘要】本发明公开了转基因动物的制备方法。本发明将胞浆DNA注射法与piggyBac转座系统介导的基因整合技术结合，建立一种高效简便的转基因动物制备方法。该方法不仅提高了外源基因整合效率，也使试验操作更简便，解决了制备转基因哺乳动物过程中遇到的操作繁琐、难度大、制备效率低的关键问题。本发明建立的高效而简便的转基因动物制备方法无论对促进哺乳动物的转基因育种，还是对促进转基因动物在人类生物医药研究领域的应用都具有重大意义。
【专利说明】转基因动物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种高效、简便的制备转基因动物的方法，具体为利用胞浆DNA注射法结合piggyBac转座系统介导基因整合技术制备转基因动物的方法。
【背景技术】
[0002]制备转基因动物的效率及操作难度主要由两个方面决定:一是制备转基因动物时采用的显微操作技术，目前常用的主要包括原核显微注射、胞浆单精注射、体细胞克隆；二是制备转基因动物时用于介导外源基因整合的方法，目前常用的主要包括普通线性化质粒介导、病毒载体介导、转座系统载体介导。
[0003]对于某些哺乳动物(如猪、牛)，其原核包裹着脂滴，在显微镜下难以观察到清晰的原核，若通过理化处理进行原核观察，如对受精卵进行离心，使胞浆的脂肪颗粒沉积在一边，这不但增加了操作步骤，而且会对受精卵的发育能力造成较大的负作用。以制备转基因猪为例，一般情况下，原核显微注射法制备转基因猪的效率约为1% (转基因猪数/移植的注射胚胎数)。胞浆单精注射法和体细胞克隆法虽然也常用于制备转基因动物，但用这两种方法制备转基因动物的效率普遍也比较低。此外，用体细胞克隆法生产的转基因动物通常存在各种各样的发育缺陷，较多难以健康存活到成年。
[0004]人们一直希望尝试另一种途径:胞浆DNA注射法，通过胞浆注射基因获得转基因动物。胞浆DNA注射法由于不需对受精卵离心即可进行DNA注射，并且胞浆的空间比雄原核大得多，注射时所需的操作精细度和难度相对较小，所以，从操作上来说，胞浆DNA注射法比原核显微注射法更简便。
[0005]此外，转基因动物的制备效率还受所采用的介导外源基因整合方法的影响。在早期的制备转基因动物的研究中，外源基因一般是通过线性化的普通质粒介导整合，具体操作是将携带外源基因的线性化普通质粒注射到受精卵的雄原核，或在体细胞核移植前转染供体细胞，或在胞浆单精注射前与破膜的精子共孵育。这种介导外源基因的整合方法虽然简单，但外源基因在宿主基因组的整合效率通常很低，一般只有等宿主基因组发生断裂修复时才会被动地整合到宿主基因组中。而利用病毒载体或转座系统载体介导外源基因整合时，由于它们采用的是主动整合的机制，它们介导外源基因在宿主基因组的整合效率比普通线性化载体显著提高。但在这两种高效的介导外源基因整合的载体中，病毒载体携带的外源基因长度远小于转座系统载体，并且其引起的生物安全风险较大，所以转座系统载体较病毒载体更优越更安全。而在目前常用的转座系统载体中，曾有研究报道PiggyBac转座系统介导的基因整合效率优于其它的转座系统(包括Sloping Beauty (SB)、Tol2和Mosl等。[0006]本发明将胞浆DNA注射法与piggyBac转座系统介导的基因整合技术有效结合，建立起一种高效、简便的制备转基因动物的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种转基因动物的制备方法。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
[0009]转基因动物的制备方法，包括以下步骤:
[0010]I)将携带有外源基因的piggyBac转座子系统质粒通过胞浆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵；
[0011]2)将注射后得到的胚胎移植至受体母体，产出表达外源基因的转基因动物。
[0012]优选的,步骤I),将携带有外源基因的piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒共同通过胞浆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵。
[0013]优选的，piggyBac转座子系统质粒的浓度为IOng/ μ L~50ng/ μ L。
[0014]优选的,piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的0.5~2倍。
[0015]优选的，piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的2倍。
[0016]优选的，步骤I)中，体外受精完成后16~18h，对受精卵进行胞浆注射；或人工授精后，收集受:精卵，在授精后24~28h对其进行胞衆注射。
[0017]优选的，步骤I)，在倒置显微镜上，用注射针引入piggyBac转座子系统质粒，或piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒,将注射针移入操作液液滴内，固定卵母细胞或体外受精卵或体内受精卵，使其第一极体处于视野12点钟或者6点钟位置,注射针在3点钟部位与透明带接触后推动注射针，当针穿透卵质膜后，控制注射针将DNA注入胞浆内。
[0018]优选的，注射体积为10pL。
[0019]优选的，步骤2)，将注射后培养16~20h获得的胚胎移植至受体母体。
[0020]优选的,所述转基因动物为猪。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]本发明针对现有技术的盲点，将胞浆DNA注射法与piggyBac转座系统介导的基因整合技术结合，并提出胞浆注射DNA制备转基因动物的最佳工艺，建立一种高效简便的转基因动物制备方法。该方法不仅提高了外源基因整合效率，也使试验操作更简便，解决了目前在制备转基因哺乳动物——特别是猪的过程中遇到的操作繁琐、难度大、制备效率低的关键问题。
[0023]本发明建立的高效而简便的转基因动物制备方法无论对促进哺乳动物的转基因育种，还是对促进转基因动物在人类生物医药研究领域的应用都具有重大意义。本发明方法适用于制备包括猪的各种转基因动物。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1 为实施例1胞浆注射piggyBac转座系统质粒后制备的绿色荧光猪胚胎。
[0025]图2为实施例1绿色荧光猪囊胚的PCR检测结果。
[0026]图3为实施例2转基因猪胎儿EGFP的表达情况。
[0027]图4为实施例2绿色荧光猪胎儿的PCR检测结果。
[0028]图5显示了出生后约2小时死亡的I头转基因猪全身组织器官EGFP表达情况。[0029]图6显示了 I头龄健康转基因猪全身组织器官EGFP表达情况。
[0030]图7为胞浆注射piggyBac转座系统质粒获得的绿色荧光转基因猪的PCR检测结
果O
【具体实施方式】
[0031 ] 下面结合实施例，进一步阐述本
【发明内容】
。
[0032]以下实施例中所用piggyBac转座系统质粒G3-EGFP (Urschitz et al, 2010)由美国夏威夷大学Dr.Mosiyadi赠送；piggyBac转座酶表达质粒mPB(Wang et al, 2008 ；Cadinanos et al，2007)由英国威康信托基金会桑格研究所赠送；pEGFP_Nl质粒由本课题组保存。分别采用omega公司无内毒素质粒抽提试剂盒纯化质粒，质粒经酶切鉴定后用于胞浆注射。
[0033]培养液TCM199购自Gibco公司，其余主要试剂除特别说明均购自Sigma公司。
[0034]实施例1
[0035]1、卵母细胞和体外受精卵的制备
[0036]卵母细胞的收集:从屠宰场收集猪卵巢,先用生理盐水清洗干净,然后用带有18号针头的注射器抽取卵泡中的卵母细胞，37°C水浴静置，去上清，加入DPBS重悬沉淀，在体视显微镜下挑选出细胞质均匀、卵丘致密且包裹2层以上的卵丘细胞-卵母细胞复合体(Cumulus oocyte complexes, COCs)。用DPBS和M199成熟培养液分别洗漆后,转入含M199成熟培养液的四孔板中，上覆胚胎级矿物油，在39°C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养42~44h后，转移到含透明质酸酶的离心管中，吹打混匀，将液体转移到培养皿中，用口吸管将脱去卵丘的卵母细胞拣出。洗涤后于体视镜下将带有第一极体的成熟卵母细胞挑出备用。
[0037]体外受精卵的制备:将成熟的卵母细胞用受精液(成分为6.3126g/L NaCl,
0.7455g/L KCl，00476g/L KH2PO4,0.2106g/L NaHCO3,0.05g/L 肝素钠，0.2425g/L 咖啡因，0.1801g/L 葡萄糖，0.02g/L 内酮酸钠，3g/L BSA, 0.0986g/L MgSO4.7H20 和 0.77075g/L 乳酸钙)洗3遍，然后移入在39°C、5% CO2、最大相对湿度的培养箱内平衡4h以上且盖有石蜡油的50 μ L受精液液滴中，每滴30枚左右卵母细胞，放入培养箱内等待受精。在上述每个盛有卵母细胞的50 μ L的受精液液滴中加入50 μ L精液(精液由广东温氏食品集团股份有限公司新兴种猪分公司提供，精子最终浓度为1 X 1O6个/mL)。精子和卵子在培养箱内共孵育6~8h后，将受精后的卵母细胞转移到含500 μ L操作液(成分为7.696g/L NaCl, 0.168g/L NaHCO3,0.356g/L KC1，0.162g/L KH2PO4,0.293g/L MgSO4.7Η20，lg/L葡萄糖，0.146g/L谷氨酰胺，1.50lg/L 牛磺酸，2.383g/L HEPES, 4g/L BSA, 0.065g/L 青霉素，0.050g/L 链霉素)的离心管中，用移液器吹打I~2min后将液体转移到培养皿中，加入适量操作液稀释，用于胞浆注射。
[0038]2、胞浆注射
[0039]在倒置显微镜上，用注射针引入一定量的质粒DNA溶液后，将注射针移入操作液液滴内，用固定针将卵母细胞或受精卵固定好，使其第一极体处于视野12点钟或者6点钟位置，注射针在3点钟部位与透明带接触后推动注射针，当针穿透卵质膜后，控制注射针将DNA注入卵母细胞胞浆内。注射针内直径约为10μm。每个卵母细胞或受精卵的注射体积为10pL。为确定胞衆DNA注射piggyBac转座系统质粒制备转基因猪胚胎的最佳条件及效率，共设计以下4组试验。
[0040]A组:注射不同浓度G3-EGFP至孤雌激活前的卵母细胞胞浆，比较其制备绿色荧光胚胎效率来确定G3-EGFP的最佳注射浓度。
[0041]B组:共注射G3-EGFP和不同浓度mPB至孤雌激活前的卵母细胞胞浆，比较其制备绿色荧光胚胎效率来确定额外添加转座酶质粒mPB后是否可提高制备绿色荧光胚胎效率，并获得mPB的最佳注射浓度。
[0042]C组:分别注射piggyBac转座系统质粒与普通质粒pEGFP_Nl至孤雌激活前的卵母细胞胞浆，比较两者制备绿色荧光胚胎效率。
[0043]D组:在不同时间点注射piggyBac转座系统质粒至体外受精卵，比较不同时间点注射piggyBac转座系统质粒对制备绿色突光胚胎效率的影响。
[0044]3、卵母细胞的孤雌激活
[0045]将A、B、C组注射后平衡好的卵母细胞进行电激活(4KV/cm，80l.! s，2次)。在39°C，5% CO2，饱和湿度的CO2培养箱中培养7d观察卵裂率、囊胚率以及绿色荧光蛋白表达情况。
[0046]4、胞楽;注射piggyBac转座系统质粒制备的绿色突光猪囊胚的PCR检测
[0047]为确定表达绿色荧光蛋白猪囊胚中是否有EGFP基因整合至基因组DNA，以随机挑选的9枚绿色荧光蛋白猪囊胚的总DNA为模板进行EGFP、PB5' TR(piggyBac转座子5’末端重复序列+5’末端外的质粒骨架序列)的PCR鉴定，以β -actin作为内参对照。
`[0048]引物序列为:
[0049]EGFP-F:TTGATGCCGTTCTTCTGCTTG(SEQ ID N0.1)；
[0050]EGFP-R:ACGTGCTGGTTGTTGTGCTGT(SEQ ID N0.2):
[0051]PB5' TR-F:CAACGACTACGCACTAGCCAACA(SEQ ID N0.3)；
[0052]PB5' TR-R:TCCTCGGCAAACTCTTTCCAT (SEQ ID N0.4)；
[0053]β -actin-lF:GCCGACAGGATGCAGAAGGA(SEQ ID N0.5)；
[0054]β -actin-lR:GGGGCCGGACTCGTCGTACT(SEQ ID N0.6)。
[0055]5、试验结果:
[0056](I)胞浆注射不同浓度G3-EGFP质粒对制备绿色荧光猪胚胎效率的影响
[0057]为了摸索最佳的G3-EGFP质粒浓度用于胞浆注射制备绿色荧光猪胚胎，试验A组中分另1J 注射浓度为 2ng/ μ L、IOng/ μ L、50ng/ μ L、250ng/ μ L、380ng/ μ L、500ng/ μ L、770ng/ μ L、1000ng/ μ L的G3-EGFP质粒至卵母细胞胞浆。结果显示当注射的G3-EGFP质粒浓度为lOng/μ L和50ng/l.! L时，获得绿色荧光胚胎的效率最高，分别为57.55%和52.63% (表1)。这表明当注射的G3-EGFP质粒浓度介于IOng/μ L和50ng/μ L之间时，获得绿色荧光的胚胎效率可能最高。因此设定后期试验用于胞浆注射的G3-EGFP质粒浓度为20ng/μ L0
[0058]表1胞浆注射不同浓度G3-EGFP质粒对制备绿色荧光猪胚胎效率的影响
[0059]
【权利要求】
1.转基因动物的制备方法，包括以下步骤: 1)将携带有外源基因的PiggyBac转座子系统质粒通过胞浆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵； 2)将注射后得到的胚胎移植至受体母体，产出表达外源基因的转基因动物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤1)，将携带有外源基因的piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒共同通过胞衆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于=PiggyBac转座子系统质粒的浓度为lOng/M-L ~50ng/ML。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于:piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的0.5~2倍。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的2倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤I)中，体外受精完成后16~18h,对受:精卵进行胞衆注射；或人工授精后，收集受:精卵，在授精后24~28h对其进行胞衆注射。
7.根据权利要求1~6任意一项所述的制备方法，其特征在于:步骤I)，在倒置显微镜上，用注射针引入piggyBac转座子系统质粒,或piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒，将注射针移入操作液液滴内，固定卵母细胞或体外受精卵或体内受精卵，使其第一极体处于视野12点钟或者6点钟位置，注射针在3点钟部位与透明带接触后推动注射针，当针穿透卵质膜后，控制注射针将DNA注入胞浆内。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于:注射体积为10pL。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤2)，将注射后培养16~20h获得的胚胎移植至受体母体。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述转基因动物为猪。
【文档编号】C12N15/85GK103710386SQ201310737657
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】吴珍芳, 曾芳, 李紫聪, 刘德武, 石俊松 申请人:华南农业大学