专利名称：一种转基因动物的制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域。
背景技术：
转基因动物(Tmnsgenic animal)指基因组中整合有外源基因，并能表达和遗传的一 类动物。转基因体系打破了自然情况下的种系隔离，使基因能在种系遥远的机体间流动， 既可加快家畜品种的改良力度，提高畜产品品质，又可生产珍稀药用蛋白。转基因技术 是20世纪遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术。
制备转基因动物的途径有多种，如显微注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干细胞介 导法，电转移法，人工酵母染色体法及体细胞核移植转基因法等。
在上述几种转基因动物制备的方法中，均存在转染效率低或操作较为繁杂等缺点， 相对而言，为研究者认可的最常用于制作转基因动物的方法是DNA显微注射法。但该 法在大动物(牛、羊、猪)上存在着所用的专用设备和试验成本昂贵、操作技术复杂、 转基因效率低(0.1% 3.5%)等问题，而且原核注射方法所用的注射针很细(约 0.78pm),故不能操作携带大片段外源基因的重组体。此外，有些动物的合子含有丰 富的脂肪，不易观察，操作起来很不方便。
精子介导外源基因转移技术(简称精子载体法)的出现为转基因动物的生产提供了 一条新途径。由于该方法实施简便，可在几乎所有动物上应用，成本低，转基因效率高 (10%以上)，对卵原核无损害，符合生理受精过程，并且结合人工授精(AI)途径就可以 大规模地开展转基因动物生产，尤其适合对泌乳量高的动物(如牛、山羊)实施外源基因 转移，因而成为近年来转基因动物研究的热点之一。
精子介导外源基因转移技术又包括孵育法、胞质内显微注射法、睾丸直接注射法。 这些方法通过不断改进，其转基因效率有所提高，但仍存在随机整合，表达不稳定，不 同畜种间转基因效率差异大，条件难以控制和重复性差等问题。
"睡美人"(Sleeping Beauty , SB)转座系统属于Tcl/mariner转座子家族，已失 活了一千多万年。直到1997年Ivies等基于积累的系统发生数据，利用生物信息学的方 法，收集的8个不同鱼类品种的12个失活的鲑鱼科亚家族，对Tcl类转座酶的基因序 列多重序列比对，以其中5个同源性较高的保守结构域进行了重建。在T元件的选择上，Ivies等选择了保守性最好的一个品种Tanichthys albonubes的IR/ DR作为"睡美人" 转座酶特异识别的DNA序列，这样带有T元件的转座子和介导其转座的转座酶一同构 成了完整的"睡美人"转座系统。至此，"睡美人"终于苏醒了。近年来对"睡美人"转座 系统的转座效率和转座机理进行研究，结果表明SB转座子在转基因，基因筛选，促进 外源基因表达及基因治疗等领域具有广阔的应用前景。
SB转座子系统能将LacZ和GFP等报告基因整合，进入多个物种和细胞系中，并 可以稳定地表达。Dupuy等将带有GFP或"go力基因(决定小鼠毛色)的转座子线性化 后，与体外转录的编码转座酶的mRNA—同注射入小鼠的单细胞胚胎，结果提高了转 基因的效率，转入的外源基因也能通过生殖细胞传递给后代。Harris等选取稳定转染 SB-RFP质粒的克隆放于不含G418的培养基中继续传代培养6个月，有90%的Hela 细胞仍可以高效地表达红色荧光蛋白，表明外源基因已经稳定地整合到染色体中。
SB作为基因转移载体具有以下优势a.结构简单，与外源基因共同整合入受体基因 组的只是两侧各250bp的IR/DR序列，对外源基因的影响较小，在整合位点也没有发 现大片段的丢失和染色体重排现象。b.与反转录病毒载体相比，对插入片段的长度限制 较小。c.转座的外源基因可以稳定整合到染色体中，而且通过生殖细胞传代后也能够长 期地表达。d.转座酶可以催化单拷贝的基因精确的插入受体序列中，不再依靠随机整合 且插入片段的大小也不会发生变化。e.转座子系统可全部以裸露的DNA形式给予，也可 以DNA (转座子)与RNA/蛋白质形式提供的转座酶相结合进行转座，所以其免疫原性 较低。
发明内容
本发明的目的在于建立一种高效稳定的转基因动物制备方法。 本发明的技术方案是先构建含目标基因cDNA的转基因表达盒，再将其插入睡 美人转座子载体中获得含转基因表达盒的睡美人转座子表达载体，然后使用睡美人转座 系统介导，采用双侧睾丸多点注射法，将含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒和睡 美人转座酶表达质粒注射雄性动物体内；再与雌性动物交配，动物分娩后，利用聚合酶 链式反应和Southern印迹技术分析确定转基因阳性个体。 本发明更为具体的方案是包括以下步骤 (1)转基因表达盒构建以常规方法构建转基因表达盒，通常包括启动子、目标基因CDNA、 3'调控区；
(2) 含转基因表达盒的睡美人转座子载体的构建将构建好的转基因表达盒插入 睡美人转座子载体中获得含转基因表达盒的睡美人转座子表达载体；
(3) 睾丸注射制备转基因动物 质粒准备常规方法制备纯化含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒和睡美人转
座酶表达质粒，用HBS溶解，转座子与转座酶的比例优选为5-10: 1,混合物中质粒的 含量为5-10ug/ uL，将一定量的转座子与转座酶混合物用基因包裹剂PEI按PEI:总 DNA-2:1比例包裹后，37。C温育10分钟备用；PEI的使用浓度为10毫克/亳升； 睾丸注射将成年雄性动物麻醉后注射载体；注射后与雌性动物进行交配；
(4) 转基因动物的整合检测动物分娩后，采集后代的血细胞或组织提取DNA， 利用聚合酶链反应(PCR)和Southern印迹技术分析确定转基因阳性个体。
上述步骤(3)中所说的睾丸注射，更为具体的操作是用75%的酒精棉擦拭睾丸， 用4号针头进行双侧睾丸多点注射，针头进入睾丸后应避开血管，缓慢移动，注射单点 完毕后应缓慢移出针头，并将注射完毕的动物放于室温下苏醒。共注射三次，每次间隔 3天。注射剂量根据动物睾丸的大小，以小鼠为例，单侧睾丸约为30-50ug;其它动物 注射单侧睾丸约为50-2000 ug。最后一次注射后隔20-50天与雌性动物进行交配。
本发明的方法适用于猪、羊、牛、鸡、兔、狗、鼠等。
本发明借助SB转座子系统介导，并通过大量实验，进行睾丸注射法制备转基因动 物过程中若干技术方案的优化，包括不同规格注射器选择、注射次数的选择、注射剂量、
转座子与转座酶的比例选择等，成功建立了一种高效稳定的转基因动物制备方法。戶万 建立的转基因动物制备方法具有阳性率高、节省时间、试验成本低、实用、 操作简单等优势。
图l， pT2-EGFP构建流程示意图 图2， FO代转基因个体的PCR扩增结果 图3，转基因小鼠的精囊腺冰冻切片荧光检测
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施 例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所 用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用 相同试剂如无特殊-说明，均以首次标明的内容相同。
本发明实施例中所使用的
pcDNA3. 0质粒来自Invitrogen公司， pEGFP-Nl质粒来自Clonetech公司，
睡美人转座酶质粒和转座子质粒(Perry B Hackett， Integrating腿vectors for gene therapy， Mol Ther. 2007 January; 15(1) : 10-12)由Hackett教授(University of Minnesota, USA)惠赠；
TA克隆载体pMD18-T来自于日本宝生物公司。
实施例制备转基因小鼠(目标基因猪精浆蛋白II基因调控区和绿色荧光蛋白 报告基因)
1、转基因表达盒构建根据Genbank已发表的猪精浆蛋白II基因序列(AJ853849)， 设计引物，以长白猪基因组为模板，用高保真DNA聚合酶扩增PSP-II基因5'和3' 侧翼区，长度分别为4087bp和3094bp，序列分别如SEQ ID NO.l和SEQ ID NO.2所示； 切胶回收纯化目标DNA片段，然后按常规方法克隆入TA克隆载体pMD18-T,筛选阳 性克隆，并对阳性克隆进行酶切和测序鉴定，得到含猪精浆蛋白II基因5'和3'端侧 翼区的pMD18-T-PSPI15和pMD18-T-PSPID重组质粒。将pMD18-T-PSPII3和 pMD18-T-PSPII5依次亚克隆入改造的过pcDNA3.0 (所说的改造的过pcDNA3.0，是指 用限制酶PvuII消化pcDNA3.0载体，切除其中的neo基因及其表达调控序列。)，得到 含4087bp的猪精浆蛋白II基因5'端侧翼区和含3094bp的猪精浆蛋白II基因3'端侧 翼区的重组质粒pcPSPII。将pcPSPII重组质粒用MM进行酶切，pEGFP-Nl用HindIII 和NotI进行酶切，电泳后切胶回收纯化目的片段，进行补平，连接，转化，筛选阳性 克隆，进行酶切和测序鉴定，构建成含荧光蛋白报告基因的猪精囊腺生物反应器重组载 体，命名为pC-EGFP 。
用于克隆的引物序列为5'侧翼区上游引物为
5， —AG rCGC04 TGA GTT GAG GGG TAT TCA CCA A AC 一3'，在引物中引进 了NruI酶切位点(下划线处)，
5'侧翼区下游引物为
5， 一AT GG度C爿CGCGrCTC AGC AGC CTG GCC CTAGC— 3，在引物中引 进了 Kpn I和Mlu I酶切位点(下划线处)。
3'侧翼区上游引物为
5， CTGGMCCTGC TGTAAT CATTTTGAATAAAG 3，，在引物中引进了 Kpnl 酶切位点(下划线处)，
3'侧翼区下游引物为
5' AT CrC04G GTG AAC TGT TTA CCA TGA ATT GT 3 ，，在引物中引进了 Xhol 酶切位点(下划线处)。
2、 含转基因表达盒的睡美人转座子载体的构建用NruI和XhoI内切酶消化表达 质粒pC-EGFP，切出含PSP-II基因5，侧翼区，EGFP及3，侧翼区的转基因表达盒， 进行补平，纯化回收目标片段。用EcoRV内切酶消化pT2-HB转座子质粒，纯化回收 目标片段，然后进行连接，转化，筛选阳性克隆，构建成含猪精浆蛋白II基因和绿色 荧光蛋白报告基因转基因表达盒的睡美人转座子表达载体。命名为pT2-EGFP。构建过 程见图1。
3、 睾丸注射制备转基因小鼠
质粒准备:制备含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒、睡美人转座酶表达质粒， 用HBS溶解，转座子与转座酶的比例优选为10: 1，混合物中质粒的含量为5-10ug/uL， 将6uL转座子与转座酶混合物用基因包裹剂PEI按PEI:总DNA-2:1比例包裹后，37 'C温育10分钟备用。PEI的使用浓度为10毫克/毫升。
睾丸注射取5只成年公鼠麻醉后用于注射载体。用75%的酒精棉擦拭睾丸，用 4号针头进行双侧睾丸多点注射，单侧睾丸约为30-50ug，针头进入睾丸后应避开血管， 缓慢移动，注射单点完毕后应缓慢移出针头，注射完毕放于室温下苏醒。共注射三次， 每次间隔3天。最后一次注射后隔20天与5只母鼠进行交配。5只母鼠经妊娠后共生出60只F0代小鼠。
PCR法检测转基因阳性小鼠
剪取刚出生F0代小鼠尾尖40mg左右，常规方法提取基因组。然后参照PSP-II基 因全序列，用primer3.0设计引物分别进行转基因阳性个体的PCR检测。上游引物为 5'-GAC AGA TGC CCT GAC AC A GA-3';下游引物为5'-CGA TCC TTA ACC CAC TGA GC-3'。 PCR循环参数为:95。C预变性5min; 94。C变性40s， 60。C复性30s， 72。C延伸 40s，共30循环；然后72'C延伸10min,最后4。C保存。PCR结束后取10pl PCR扩增 产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，在凝胶成像仪上观察并拍照。PCR扩增结果见 图2，转基因阳性个体的PCR产物大小为380bp，与预期片段大小相符，其中泳道I-IO 为转基因FO代小鼠的基因组PCR产物，其中3、 6、 8、 9、 IO泳道为阳性个体，泳道 a的PCR扩增模板为阴性小鼠的基因组,泳道b的PCR扩增模板为阳性质粒pC-EGFP, 标准参照为DL2000 DNA Ladder Marker。其中60只小鼠的PCR检测转基因阳性率为 42.7%。
转基因小鼠的表达检测
采集转基因阳性小鼠的精囊腺组织，制作冰冻切片，在荧光显微镜下观察。结果如 图3所示，转基因阳性小鼠的精囊腺上皮细胞层等在荧光显微镜下可被激发出绿色荧光 (图3b)，而野生型公鼠则不能激发出绿色荧光(图3a)。<110>扬州大学
<120>—种转基因动物的制备方法
<160>2
<210>1 <211>4087 <212> DNA <213>家猪(SusScrofa)
<400>1
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309权利要求
1、一种转基因动物的制备方法，其特征是，先构建含目标基因cDNA的转基因表达盒，再将其插入睡美人转座子载体中获得含转基因表达盒的睡美人转座子表达载体，然后使用睡美人转座系统介导，采用双侧睾丸多点注射法，将含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒和睡美人转座酶表达质粒注射雄性动物体内；再与雌性动物交配，动物分娩后，利用聚合酶链式反应和Southern印迹技术分析确定转基因阳性个体。
2、如权利要求l所述的方法，其特征是，具体步骤为-(1) 转基因表达盒构建以常规方法构建包括启动子、目标基因cDNA、 3'调控区 转基因表达盒；(2) 含转基因表达盒的睡美人转座子载体的构建将构建好的转基因表达盒插入睡 美人转座子载体中获得含转基因表达盒的睡美人转座子表达载体；(3) 睾丸注射制备转基因动物 质粒准备:制备纯化含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒和睡美人转座酶表达质粒，用HBS溶解，转座子与转座酶的比例优选为5-10: 1，混合物中质粒的含量为5-10ug/ uL，将一定量的转座子与转座酶混合物用基因包裹剂PEI按PEI:总DNA=2:1比例包裹 后，37'C温育10分钟备用；PEI的使用浓度为10毫克/毫升；睾丸注射将成年雄性动物麻醉后注射载体；注射后与雌性动物进行交配；(4) 转基因动物的整合检测动物分娩后，采集后代的血细胞或组织提取DNA，利 用聚合酶链式反应和Southern印迹技术分析确定转基因阳性个体。
3、如权利要求2所述的方法，其特征在于所述动物为猪、羊、牛、鸡、兔、狗或鼠。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于上述步骤(3)中所说的睾丸注射，采用双侧 睾丸多点注射的方法，共注射三次，每次间隔3天；最后一次注射后隔20-50天与雌性动 物进行交配。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于注射剂量为单侧睾丸约为30-2000 ug。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于所述动物为鼠，注射剂量单侧睾丸为30-50 ug。
全文摘要
本发明公开了一种转基因动物的制备方法。具体是先构建含目标基因cDNA的转基因表达盒，再将其插入睡美人转座子载体中获得含转基因表达盒的睡美人转座子表达载体，然后使用睡美人转座系统介导，采用双侧睾丸多点注射法，将含转基因表达盒的睡美人转座子表达质粒和睡美人转座酶表达质粒注射雄性动物体内；再与雌性动物交配，动物分娩后，利用聚合酶链式反应和Southern印迹技术分析确定转基因阳性个体。本发明在转基因动物的制备过程中使用“睡美人”转座系统介导，采用双侧睾丸三次多点注射法，所建立的转基因动物制备方法具有阳性率高、节省时间、试验成本低、实用、操作简单等优势。
文档编号C12N15/90GK101289671SQ20081012395
公开日2008年10月22日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者晗 吴, 孙丽亚, 宋成义, 王宵燕, 飞 谢, 芹 赵, 陈国宏, 波 高 申请人:扬州大学