专利名称：：一种Solexa技术鉴定结肠癌病人血清中微小核糖核酸的方法
技术领域：
：本发明属于生物医药
技术领域：
。具体涉及一种测定血清微小核糖核酸表达的Solexa技术，以及Solexa技术在结肠癌临床诊断方面的应用。二
背景技术：
：近年来，结肠癌的发病率呈不断上升态势，目前已位居恶性肿瘤的第4位。结肠癌的发病机制尚未完全明了，目前认为它的发生主要是遗传和环境因素长期相互作用的结果。研究表明，结肠癌的形成可能需要IO年时间，仅从内窥镜下可辨认的腺瘤发展成侵袭性癌就需要5年左右的时间。早期结肠癌是可以治愈的，但进展期的结肠癌则预后较差，目前国内结肠癌病人术后5年存活率仅60%左右。早期发现、早期诊断是治疗和改善结肠癌预后的关键。结肠癌不易早期诊断有如下原因1)起病隐匿，临床表现缺乏特异性，待临床确诊时己属中晚期。2)医生对腹痛、腹泻、便血、贫血等症状缺乏与结肠癌联系的警惕性。3)缺乏在特殊情况下诊断结肠癌的警惕性，如对青年人结肠癌更容易疏忽，而青年人结肠癌往往分化低，预后差，因而延误诊断。随着医学检测技术的发展，近年来开发了诊断早期结肠癌的一些方法，主要包括大便潜血试验、结肠镜检查和肿瘤基因检测。这些检测方法目前对于及时发现可治愈的癌前病变或早期癌具有相当重要的临床意义。大便潜血试验(Faecaloccultbloodtest)是结肠癌普査最常用方法，但其诊断结肠癌的特异性只有20%30%。大便潜血试验中，化学法粪便隐血试验价格低廉，但假阳性较多，而免疫法虽特异性强，然而价格昂贵。为进一步提高大便潜血试验的诊断价值，推荐两步"序贯"筛査即先用化学法初筛，阳性者再进行免疫法复查，再阳性者进行结肠镜检查。但如此而来使检查复杂化，不利于推广。结肠镜检査是目前诊断早期结肠癌的主要方法,其准确率达90%95%。尽管如此，作为侵入性检査的结肠镜使病人承受较大的痛苦，并且价格昂贵，检测技术要求高，也不能作为常规的检测手段。基因检测最具发展前景，特别是基因APS、DCC和DNA错配修复基因的检测能明确诊断早期结肠癌，甚至结肠癌形成之前就可以掌握其发展趋势。但是目前基因检测方法缺乏人群筛检资料的支持，存在基因检测数目的灵敏度、特异性基因的选择和检测费用过高等问题，不能推广使用。目前非常有必要研究开发新型、灵敏并应用方便的结肠癌早期诊断标志物。微小核糖核酸，英文名为microRNA，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子。它们在进化上高度保守，并与动物的许多正常生理活动，如生物个体发育、组织分化、细胞调亡、能量代谢等密切相关。最近研究发现当癌症发生时，组织特异性微小核糖核酸的表达水平相对于正常组织发生了变化，提示微小核糖核酸表达及特异性变化与疾病发生和发展之间存在着必然联系。本发明人之前已经开展了微小核糖核酸作为结肠癌组织标志物的研究，发现在结肠良性息肉发展成恶性肿瘤期间，一些微小核糖核酸分子都存在着特异性变化，并据此通过测定微小核糖核酸的特异性变化建立一种更敏感、更精确的早期确诊结肠癌方法。由于组织标本取材不容易，使这种方法在临床上的广泛应用受到了限制。本发明人将研究目光投向较易获得，甚至常规体检中就可以收集到的血液，进行了血清/血细胞微小核糖核酸分子作为癌症标志物方面的研究。目前研究微小核糖核酸的方法主要有RT-PCR、Real-timePCR、Northernblotting、RNaseprotectionassay和生物芯片等。但是这些方法都有其不足之处。RT-PCR和Real-timePCR存在实验费用高、通量较低等问题。Northernblotting能直观显示并检测前体和成熟体微小核糖核酸，但是操作繁琐、敏感性和实验通量低。生物芯片技术虽然高通量、低成本，但是敏感性和重复性都需要提高。令人振奋的是一种革新性的分子生物学综合技术平台Solexa测序方法正逐渐进入人们视野。Solexa测序方法基于单分子克隆阵列技术，能够在整个基因组水平上区分单个碱基的差异，从而区分个体间的差异。Solexa技术有如下独特优点1)不受物种限制，人，动物，微生物，植物都可进行研究；2)高灵敏度，高精确性，高通量和高重复性和低运行成本；3)无需预先知道模式物种基因组序列，无须合成探针，可直接进行全基因组表达研究；4)不需要实验假设的支持；5)可以检测到单拷贝分子的变化；6)没有传统方法的荧光背景噪音的干扰。利用Solexa技术可以同时完成传统基因组学研究(测序和注释)以及功能基因组学(基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)的研究。由于微小核糖核酸可以作为一类新型疾病标志物分子，我们通过Solexa方法来研究结肠癌病人血清/血细k微小核糖核酸的表达谱以其与疾病的相关性，用Solexa方法筛选和鉴定结肠癌血清中微小核糖核酸并研究其在肿瘤发生过程中的特异性变化，建立一种用于结肠癌早期诊断，病程监控，恶性复发及预后，并发症预测的新技术。
发明内容本发明所要解决的问题是用Solexa测序技术检测结肠癌病人血清中微小核糖核酸并分析鉴定其稳定性和表达量。本发明涉及结肠癌病人血清的提取方法。本发明还涉及Solexa测序技术分析并鉴定人结肠癌血清中微小核糖核酸的表达谱。本发明提供一种评价结肠癌病人病理状态的微小核糖核酸组合，所述组合包括Solexa方法能够检测的结肠癌病人血清中全部微小核糖核酸。将其与正常人血清微小核糖核酸表达谱进行比较，筛选出特异性变化的一系列微小核糖核酸，用于疾病的诊断、药物的筛选、治疗方案的评价。实现本发明目的的技术方案为取得正常人和结肠癌病人的血清样本，通过Solexa测序技术分析并鉴定结肠癌病人血清中微小核糖核酸。通过与人结肠癌血清微小核糖核酸的PCR产物进行序列比对，进一步验证血清微小核糖核酸分子的存在和序列的正确性。Solexa测序可得到人结肠癌血清微小核糖核酸表达谱中各个微小核糖核酸的含量和所占比例，通过与正常人血清微小核糖核酸Solexa测序结果比对，可以筛选出在病理状态下差异表达程度大的一系列血清微小核糖核酸分子，作为结肠癌检测的标记分子。具体的人结肠癌血清微小核糖核酸的制备及分析如下(1)收集结肠癌受试者的血清样本；(2)通过Trizol试剂提取血清总RNA;(3)进行PAGE电泳回收17-27ntRNA分子;(4)进行Solexa技术的准备实验，首先在17-27ntRNA分子两个末端加上接头(adapter);(5)利用Solexa芯片固定单链RNA分子芯片表面连接有一层单链引物(Primer),RNA片断成单链后通过芯片表面引物的碱基互补被一端"固定"在芯片上；(6)引物扩增使得单链RNA成为双链；(7)将双链RNA变性后成为单链，其一端"固定"在芯片上，另外一端(5'或3')随机和附近的另外一个引物互补，被"固定"住，形成"桥"(bridge);(8)上千万RNA单分子发生同样反应形成单链桥；(9)单链桥以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增形成双链；(10)双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板，反复30轮扩增后每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆簇；(11)序列分析利用专利的"可逆性末端终结反应"，通过碱基合成来进行测序。四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列；(12)数据分析与处理。通过上述Solexa测序技术分析结肠癌血清微小核糖核酸的变化趋势和变化量及它们与结肠癌发生的相关性。确定基于Solexa测序技术的标志性微小核糖核酸作为结肠癌早期发生的临床诊断标准。本发明利用Solexa测序技术对结肠癌血清微小核糖核酸表达谱的应用与现有技术相比有其优越性-(1)Solexa测序技术具有高灵敏度，精确性，及重复性。在结肠癌血清微小核糖核酸表达谱测定中可以检测到单拷贝分子的变化。再加上样本易存放(血清-2(TC存放即可)等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，成为早期诊断疾病的有效手段。(2)利用Solexa测序技术将改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高结肠癌的临床检出率并实现结肠癌的早期诊疗。(3)利用Solexa测序技术可以筛选出一系列疾病相关微小核糖核酸标记物，它们或升高或降低再经过反复实验能具有统计学意义，因而能够克服结肠癌病人个体之间的差异(即年龄、性别、种族、饮食和环境等)，而这正是单一疾病标记物和其他检测方法所无法逾越的一个主要问题。总之，应用Solexa测序技术检测结肠癌血清微小核糖核酸表达谱来确诊结肠癌早期发生，这种新的检测方法不仅为人们在分子水平上全面了解癌症发生机理提供了基础，也加速了临床疾病诊断学和治疗学的进步。相信不久的将来，对重症疾病如癌症的Solexa测序诊断技术将会成为常规体检的一部分。四图1为Solexa测序所得正常血清和结肠癌血清的小分子RNA长度。图2显示结肠癌病人血清相对于正常人血清的微小核糖核酸变化情况。图3显示结肠癌病人血清相对于正常人血清的微小核糖核酸Pearson相关系数曲线。五具体实施例方式通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。实施例1采用Solexa测序技术对结肠癌病人血清样本进行测序并分析所含各个微小核糖核酸的表达量。具体步骤为(1)收集结肠癌病人的血清样本。(2)Trizol法(Invitrogen公司)提取上述病人100ml混合血清总RNA，通过异丙醇沉淀法浓縮RNA，用分光光度计进行定量(100ml血清通常能富集约10-20ug左右的总RNA)。(3)应用10-20ug左右的结肠癌病人血清总RNA，采用Solexa测序技术检测和分析RNA样品。具体方案为a.应用PAGE电泳，纯化得到长度小于30nt的RNA分子。在RNA分子的两个末端加上接头分子(adapter)。b.采用Solexa芯片在固定一端RNA接头分子的同时，由于其芯片表面有能与另一端RNA接头分子互补的单链引物(Primer)，从而将RNA分子"固定"在芯片上，形成单链"桥"(bridge)。c.然后进行"桥"式PCR反应使得单链RNA扩增成为双链。d.将双链RNA分子变性成为单链。两单链RNA分子的一端分别"固定"在芯片上，另外一端(5'或3')分别随机和附近芯片表面的引物互补而被"固定"住，形成两个单链"桥"(bridge)。e.上千万个"种在"芯片表面的RNA分子发生上述相同反应。f.形成的单链桥在芯片表面进行"桥"式PCR扩增反应，形成双链；双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应。每个RNA分子经过反复30轮扩增后(约1000倍扩增)，成为单克隆簇群。g.采用专利技术"可逆性末端终结反应"进行单克隆RNA簇的序列分析。四种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应只能加入一个碱基，经过扫描并读取该次反应颜色后，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出每个碱基精确序列。(4)利用生物信息学方法，对上述测得的结肠癌血清RNA分子表达谱进行分析。首先对结肠癌血清Solexa测序技术所得的小分子RNA进行归类研究，结果如表1所示。表1结肠癌血清Solexa测序所得的小分子RNA的类别结肠癌血清小分子RNA类别比例已知微小核糖核酸39.69%rRNA碎片56.27%重复1.97%mRNAs碎片组1.06%未标注1.01%我们从表l可以看到血清中存在不同种类的小分子RNA，利用生物信息学方法，我们通过序列比对将所有小分子RNA进行了归类分析。从目前的数据来看，血清中至少存在上百种微小核糖核酸，占结肠癌血清所有RNA分子的39.69%。由于血清中大分子RNA降解(包括rRNA、mRNA等的降解)，无形中增加了rRNA碎片和mRNA碎片在血清RNA分子中的比率。Solcxa测序结果所得的小分子RNA的长度分布如图1所示。大多数血清小分了RNA的长度是22nt，表明微小核糖核酸在小分子RNA中占大比重的趋势。此外，血清中小分子RNA的情况比较复杂，存在很多rRNA和mRNA的碎片，大小正好是18-30bp。具体的结肠癌血清Solexa测序结果见表2(拷贝数值反映微小核糖核酸的表达量，其中拷贝数=0表示结肠癌血清中没有微小核塘核酸；拷贝数值越大，其对应的微小核糖核酸表达量越多)。表2结肠癌血清Solcxa测序结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>54hsa-miR-2120239hs3-miR-5730424hsa-miR-574-5p1255hsa-miR-2140240hs3-miR-5750425hsa-miR-5891256hsa-miR-2150241hsa-miR-576-3p0426hsa-miR-769-5p1257hs3-miR-216s0242hsa-miR-5770427hsa-miR-106b1658hsa-miR-216b0243hs3-miR-5780428hsa-miR-142-5p1659hsa-miR-2170244hs3-miR-5790429hsa-miR-1441660hsa-miR-2180245hsa-miR-5800430hsa-miR-19b1661hsa-miR-219-2-3p0246hsa-miR-5810431hsa-miR-28-5p1662hsa-miR-219-5p0247hs3-miR-582-3p0432hsa-miR-29c1663hsa-miR-2200248hsa-miR-582-5p0433hs3-miR-3031664hsa-miR-220b0249hsa-miR-5830434hsa-miR-324-3p1665hsa-miR-220c0250hsa-miR-5850435hsa-miR_3451666hsa-miR-296-3p0251hsa-miR-5860436hsa-miR-3751667hsa-miR-2970252hsa-miR-5870437hsa-miR-409-5p1668hsa-miR-2980253hsa-miR-5880438hsa-miR-5651669hsa-miR-299-3p0254hs3-miR—590—3p0439hsa-miR-654-3p1670hsa-miR-299-5p0255hsa-miR-590-5p0440hsa-miR-9411671hsa-miR-29b0256hsa-miR-5910441hsa-miR-30e2072hsa-miR-3000257hsa-miK-5920442hsa-miK-li23-3p2073hs3_miR-301a0258hsa-miR-5930443hsa-miR-502-3p2074hsa-miR-301b0259hsa-miR-5950444hsa-raiR-5052075hsa-miR-302a0260hsa-miR-5960445hsa-miR-532-3p2076hsa-miR-302b0261hsa-miR-5970446hsa-miR-532-5p2077hs3-miR-302c0262hsa-miR-5990447hsa-miR-576-5p2078hsa-miR-302d0263hsa-miR-6000448hsa-miR-8742079hsa-miR-320264hs3-miR-6010449hsa-miR-9422080hsa-miR-3250265hsa-miR-6020450hsa—miR-106a2481hsa-miR-3290266hsa-miR-6030451hsa-miR-20a2482hsa-raiR-330-5p0267hsa-miR-6040452hsa-miR-342-5p2483hsa-miR-331-5p0268hs3-miR-6060453hsa-miR-36卜3p2484hsa-miR-337-3p0269hs8-miR-6070454hsa-miR-6602485hsa-miR-337-5p0270hsa-miR-6080455hsa-miR-886-5p2486hsa-miR-33a0271hsa-miR-6090456hsa-miR-125b28<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>120hs3-miR-450a0305hsa-miR-6430490hsa-miR-139-3p81121hsa-miR-450b-3p0306hsa-miR-6440491hsa-miR-37889122hsa-miR-4530307hsa-miR-6450492hsa-miR-486-3p93123hsa-miR-4540308hsa-miR-6460493hsa-miR-330-3p97124hsa-miR-455-3p0309hsamiR-6470494hsa-miR-433101125hsa-miR-455-5p0310hsa-miR-6480495hsa-miR-127-3p105126hsa-miR-術a0311hsa-miR—6490496hsa-miR-193a-5p105127hsa-miR-4880312hsa-miR-6500497hsa-miR-484109128hsa-miR-4890313hsa-miR-6510498hsa-miR-598117129hsa-miR-490-3p0314hsa-miR_6530499hsa-miR-328125130hsa-miR-490-5p0315hs3-miR-6550500hsa-miR-192129131hsa-miR-491-3p0316hsa-miR-6560501hsa-miR-99b133132hsa-miR-4920317hsa-miR-6570502hsa-miR-23b149133hsa-miR-4930318hsa—miR-6580503hsa-miR-27a149134hsa-miR-4940319hsa-miR-6590504hsa-miR-30c149135hsa-miR-4960320hsa-miR-6610505hsa-miR-382157136hsa-miR-4980321hsa-miR-6620506hsa-miR-432丄57137hsa-miR-499-3p0322hs3-miR-6630507hsa-miR-342-3p161138hsa-miR-5000323hs3-miR-6680508hsa~miR-26a173139hsa-miR-501-5p0324hsa-miR-671-3p0509hsa-miR-128b185140hsa-miR-502-5p0325hsa-miR-671-5p0510hsa-miR-27b190141hsa-miR-5040326hsa-miR-6720511hsa-miR-134214142hsa-miR-5060327hsa-miR-6740512hsa-let-7d218143hsa-miR-5070328hsa-miR-6750513hsa-miR-128a246144hsa-miR-508-3p0329hsa-miR-70514hsa-miR-151-3p262145hsa-miR-508-5p0330hsa-miR-7080515hsa-let-7i266146hsa-miR-509-3-5p0331hsa-miR-7580516hsa-miR-150270147hsa-miK-509-3p0332hs8-miR-7600517hsa-miR-584282148hsa-miR-509-5p0333hs3-miR-7650518hsa-miR-339-3p290149hsa-miR-5100334hsa-miR-767-3p0519hsa-let-7g294150hsa-miR-5110335hsa-miR-767-5p0520hsa-miR-339-5p298151hsa-miR-512-3p0336hsa-miR-768-3p0521hsa-raiR-29a306152hsa-miR-512-5p0337hsa-miK-770-5p0522hsa-miR-15b371<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>目前哺乳动物微小核糖核酸数据库中有555个微小核糖核酸，其中370个微小核糖核酸在结肠癌血清中没有检测到，结肠癌血清中能检测到的微小核糖核酸共185个，其中高表达量(100<拷贝数<=1000)的有40个，超高表达量(拷贝数MOOO)的有22个。但是我们注意到，小于10个拷贝数的微小核糖核酸，在全部结肠癌血清微小核糖核酸中所占的数量也不低，约占一半不到(47/185),由于这些微小核糖核酸的量极低，很可能是假阳性，还需要进一步的验证。实施例2结肠癌病人血清中微小核糖核酸较正常生理状态的变化情况用Solexa技术对正常人血清微小核糖核酸进行测序，所得结果如表3。表3正常人血清Solexa测序结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>22hsa-miR-147b0207hsa-miR-548a-5p0392hsa-miR-127-3p123hsa-miR-1490208hsa-miR-548b-3p0393hsaiiR-28-3p124hsa-miR-1530209hsa-miR-548c-3p0394hsa-miR-28-5p125hsa-miR-1540210hsa-miR-548d-3p0395hsa-miR-574-3p126hsa-miR-181c0211hsa-miR-5490396hsa-miR-301b127hsa-miR-181d0212hsa-miR-551a0397hsa-miR-499-5p128hsa-miR-1870213hsa-miR-551b0398hsa-miR-200b129hsa-miR-188-3p0214hsa-miR-5520399hsa-miR-503130hsa-m丄R-188-5p0215hsa-miR-5530400hsa-miR-582-5p131hsa-miR-190b0216hsa-raiR-5540401hsa-miR-362-3p132hsa-miR-193a-5p0217hsa-miR-5550402hsa-miR-941133hsa-tniR-193b0218hsa-miR-556-3p0403hsa-miR-328134hsa-miR-1950219hsa-miR-556-5p04(Mhsa-miR-550135hsamiR-196a0220hsa-miR-5570405hsa-136hsa-miR-1980221hsa-miR-5580406hsa-m丄R-99a137hsa-miR-200a0222hsa-miR-5590407hs3-miR-450;i138hsa-miR-2020223hsa-miR-5600408hsa-miR-574-5p139hsa-miK-203G224hsei-miR-56i0409hsa-處-548b-5p140hsa-miR2040225hsa-miR-5620410hsa-miR-330-3p141hsa-miR-2050226hsa-miR-5630411hsa-miR-589142hsa-miR-2060227hsa-miR-5640412hsa-miR-197143hsa-miR-2080228hsa-miR-5650413hsa-miR-324-3p244hsa-miR-208b0229hsa-miR-5660414hsa-miR-548d-5p245hsa-raiR-2110230hsa-miR-5670415hsa-miR-196b246hsa-miR-2120231hsa-miR-5680416hsa-miR-768-5p247hsa-niR-2140232hsa-miR-5690417hsa-miR-501-5p248hsa-miR-216a0233hsa-miR-5710418hsa-miR-9249hs3-miR-216b0234hsa-miR-5720419hsa-tniR-331-5p250hsa-miR-2丄70235hsa-miR-5730420hsa-miR-491-5p251hsa-miR-2180236hsa-miR-5750421hsa-miR-92b252hsa-miR-219+3p0237hsa-miR-5770422hsa-miR-501-3p253hsa-miR-219-2-3p0238hsa-miR-5780423hsa-miR-215254hsa-miR-219-5p0239hsa-miR-5790424hsa-raiR-30a255hsa-miR-2200240hsa-miR-5800425hsa-miR-584256hsa-miR-220b0241hsa-miR-5810426hsei-miR-273257hsa-miR-220c0242hsa-miR-5830427hsa-miR-10a358hsa-miR-296-3p0243hsa-miR-5850428hsa-miR-1359hsa-miR-2970244hsa-miR-5860429hs3-miR-769-5p360hsa-miR-2980245hsa-miR-5870430hsa-miR-122361hsa-miR-299-3p0246hsa-miR-5880431hsa-miR-505362hsa-miR-299-5p0247hsa-miR-590-3p0432hsa-miR-629363hsa-miR-3000248hsa-miR-5910433hsa-miR-125b364hsa-miR-302a0249hsa-miR-5920434hsa-miR-339-3p365hsa-miR-302b0250hsa-miR_5930435hsaiiR-193a-3p366hsa-miR-302c0251hsa-raiR-5950436hsa-miR-532-3p367hsa-miR-302d0252hsa~miR-5960437hsa-miR-744468hsa-miR-310253hsa-miR-5970438hsa—miK-155469hsa-miR-323-3p0254hsa-miR-5990439hsa-miR-345470hsa-miR-323-5p0255hsa-miR-6000440hsa-miR-598471hsa-miR-3250256hsa-miR-6010441hsa-miR-335472hs3-miR-3260257hsa-miR-6020442hsa-miR-140-5p573hsa-miR-3290258hsa-miR-6030443hsa-miR-361-3p574hsa-miR-330-5p0259hsa-miR-60404Mhsa-miR-143575hsa~miR-337-3p0260hsa-miR-6050445hsa-miR-500676hsa-miR-337-5p0261hsa-miR-6060446hsa-miR-651677hsamiR-'338-3p0262hsa-miR-6070447ksa-miR-23b678hsa-miR-338-5p0263hsa-miR-6080448hsa-miR-886-3p679hsa-miR-33b0264hsa-miR-6090449hsa-miR-576-3p680hsa-miR-342-5p0265hsa-miR-6100450hsa-miR-33a681hsa-miR-3460266hsa-miR-6110451hsa-miR-152782hsa-miR-34b0267hsa-miR-6120452hsa-miR-221783hsa-miR-34c-3p0268hsa-ni:iR-6130453hsa-miR-342-3p784hs3-miR-3650269hsa-miR-6140454hsa-miR-27b885hsa-miR-3670270hsa-miR-615-3p0455hsa-miR-1283886hsa-miR-369-3p0271hsei-miR-615-5p0456hsa-miR-128b887hsa-miR-369-5p0272hsa-miR-6160457hsa-miR-301a888hsa-miR-3700273hsa-miR-6170458hsa-miR-150989hsa-miR-371-3p0274hsa-miR-6180459hsa-miR-199a-3p1190hsa-miR-371-5p0275hsa-miR-6190460hsa-miR-199b-3p1191hsa-raiR-3720276hsa-miR-6200461hs3-miR-339-5p1192hsa-miR-3730277hsa-miR-6210462hsa-miR-331-3p1193hsaiiR-3750278hsa-miR-6220463hsa-miR-502-3p1294hsa-miR-376a0279hsa-miR-6230464hsa—miR-886—5p1295hsa-miR-376b0280hsa-miR-6240465hs3-miR-23813恥hs3-mLR-376c0281hsa—miR-6260466hsa-let-7c1397hsa-miR-3770282hsa-miR-628-3p0467hsa~iniR_590—5p1398hsa-miR-3790283hsa-miR-6300468hsa-miR-1841399hsaiiiR-3800284hsa-miR-6310柳hsa-miR-22214100hsa-miR-3810285hsa-miR-6320470hsa-miR-423-3p16101hsa-miR-3820286hsa-miR-6330471hsa-miK-lW16102hsaiiR-3830287hsa-miR-6340472hsaiiR-18b16103hsa-miR-3840288hsa-miR-6350473hsa-miR-3217104hsa-miR-409-3p0289hsa-miR-6360474hsa-miR-19a19105hsa-miR-409-5p0290hsa-miR-6370475hsa-miR-324-5p21106hsa-miR-4100291hsa-miR-6380476hsa-miR-45422107hsa-miR-4110292hsa-miR-6390477hsa-miR-42423108hsa-miR-4120293hsaiiR-6400478hsa-miR-576-5p23109hsa-miR-422a0294hsaiiR-6420479hs3-miR-9624110hsa-miR-4290295hsa-miR-6430480hsa-miR-374h24mhsa-miR-4310296hsa-miR-6440481hsa-miR-29b25112hsa-miR-4320297hsa-m:iK-6450482hsa-miR-lOO26113hsa-miR-4330298hsa-miR-6460483hsa-miR-362-5p26114hsa-raiR-4480299hsa-miR-6470484hsa-miR-66029115hsa-miR-449a0300hsa-miR-6480485hsa-miR-92329116hsa-miR-449b0301hsa-raiR-6490486hsa-miR-21030117hsa-miR-450b-3p0302hsa-miR-6500487hsa-miR-2431118hsa-miR-4520303hsa-miR-6530488hsa-miR-532-5p31119hsa-miR-4530304hsermiR-654-3p0489hsa-miR-148b33120hsa-miR-455-3p0305hs;a-miR-654-5p0490hsa-miR-12634121hs3-miR-455-5p0306hsa-miR-6550491hsa-miR-48436122hsa-miR-483-3p0307hsa-miR-6560492hsa-miR-29a37123hsa-miR-483-5p0308hsa-miR-6570493hsa-miR-18337124hsa-miR-485-3p0309hsa-miR-6580494hsa-miR-181a40125hs3-miR-485_5p0310hsa-miR-6590495hsei-miK-374340126hsa-miR-486-3p0311hsa-miR-6610496hsa-miR-22341127hsa—miR-487a0312hsa-miR-6620497hsa-miR-146b-5p45128hsa-miR-487b0313hsa-miR-6630498hsa-miR-65245129hsa-miR-4880314hsa-miR-6650499hsa-miR-30b46130hsa-miR-4890315hsa-miR-6680500hsa-miR-130b59131hsa-miR-490-3p0316hsa-miR-671-3p0501hsa-miR-9865132hsa-miR-490-5p0317hsa-miR-671—5p0502hsa-miR-151-3p66133hsa-miR-49I-3p0318hsa-miR-6720503hsa-miR-18278134hsa-miR-4920319hsa-miR6740504hs3-miR-30e79135hsa-miR-4930320hs3-miR-6750505hsa-miR-19479136hsa-miR-4940321hsa-miR-7080506hsa-miR-148a84137hsa-miR-4950322hsa-miR-7580507hsa-miR-20b99138hsa-miR-4960323hsa-miR-7600508hsa-miR-29c105139hsa-miR-4970324hs3-miR-7650509hsa-miR-146a109140hsa-miR-4980325hs3-miR-7660510hsa-miR-340109141hsa-miR-499-3p0326hsa-miR-767-3p0511hsa-miR-130a116142hsa-miR-502-5p0327hsa-miR-767-5p0512hsa-miR—18a120143hsa-miR-5040328hsa-miR-768-3p0513hsa-let-7d149144hs3-miR-5060329hsa-miR-769-3p0514hsa-miR-106a158145hsa-miR-5070330hsa-miR-770-5p0515hsa-miR-22168146hsa-miR-508-5p0331hsa-miR-8010516hsa-miR-378170147hsa-miR-509-3-5p0332hsa-miR-8020517hsa-miR-30c174148hsa-raiR-509-3p0333hsa-miR-8710518hsa-miR-423-5p198149hsa-miR-509-5p0334hsa-miR-8720519hsa-m]'R-151-5p200150hsa-miR-5100335hsa-miR-875-3p0520hsa-miR-30d201151hsa-miR-5110336hs3-miR-875-5p0521hsa-miR-425232152hsa-miR-512-3p0337hsa-miR-876-3p0522hsa-miR-26b284153hsa-miR-512-5p0338hsa-miR-876-5p0523hsa-miR-363311154hsa-miR-513-3p0339hsa-miR-885-3p0524hsa-miR-144318155hsa-raiR-513-5p0340hsa-miR-885-5p0525hsa-miR-15b319156hsa-miR-5140341hsa-miR-8870526hsaiiR-142-3p327157hsa-miR-515-3p0342hsa-miR-8880527hsa-niiR-186338158hs3-miR-515-5p0343hsa-miK-8890528hsa-miR-92a339159hsa-miR-5163-3p0344hsa-miR-8900529hsa-miR-15a465160hsa-miR-516a-5p0345hsa-miR-891a0530hsa-miR-7477161hsa-miR-516b0346hsa-miR-891b0531hsa-miR-19b484162hsa-miR-517c0347hsa-miR-892a0532hsa-miR-93510163hsa-miR-518a-3p0348hsa-miR-892b0533hsa-miR-140-3p519164hsa-miR—518a-5p0349hsa-miR-9200534hsaiiR-320526165hs8-miR-518b0350hsaiiR-9210535hsa-raiR-107545166hsa-miR-518c0351hsa-miR-9220536hsa-miR-142-5p549167hsa-miR-518d-3p0352〖Lsa-mlR-9240537hsa-miR-26a550168hsa-miR-518d-5p0353hsa-miR-9330538hsa-miR-17557169hsa-miR-518e0354hsa-miR-9340539hsa-miR-191637170hsa-miR-518f0355hsa-miR-9350540hsa-miR-192690171hsa-miR-519a0356hsa-miR-9360541hsa-lct-7b731172hsa-miR-519b-3p0357hsa-miR-9370542hsa-miR-25739173hsa-miR-519b-5p0358hsa-miR-9380543hsa-miR-21934174hsa-miR-519c-3p0359hsa-miR-9390544hsa-miR-1031003175hsa-miR-519c-5p0360hsa-miR-9400545hsa-let-7i1075176hsa-miR-519d0361hsa-miR-9430546hsa-miR-106b1401177hsa-miR-519e0362hsa-miR-9440547hsa-miR-20a1484178hsa-miR-520a-3p0363hsa-miR-950548hsa-miR-l851849179hsa-miR-520a-5p0364hsa-miR-99b0549h'sa-let-7a1965180hsa-miR-520b0365hsa-miR-133a0550hsa-let-7f2009181hsa-miR-520c-3p0366hsa-miR-199a-5p0551hsa-let-7g2058182hsa-miR-520c-5p0367hs3-miR-3430552hsa-miR-10丄2510183hsa-raiR-520d-3p0368hsa-miR-34c-5p0553hsa-miR-486-5p4395184hsa-raiR-520d-5p0369hsa-miR-4210554hsa-miR-166806185hsa-miR-520e0370hsa-miR-450b-5p055558299如果Solexa测序的数值少于1个拷贝数，我们认为是不可信的，过滤后默认为零。过滤后的结肠癌病人血清中有222个微小核糖核酸(见表2)。过滤后的正常人血清中有167个微小核糖核酸(见表3)。我们认为当微小核糖核酸的变化倍数大于5，且绝对值之差大于20个拷贝数，那么这个微小核糖核酸是显著变化的，否则视为不变化。根据此规则，我们比较了结肠癌病人血清与正常人血清的微小核糖核酸，发现77个微小核糖核酸呈上升趋势，61个呈下降趋势，84个不变化。我们分析了发生结肠癌时变化或不变化的血清微小核糖核酸所占比例，结果如图2所示。发生结肠癌时血清中微小核糖核酸相对正常人血清发生了很大变化，Pearson相关系数的分析(见图3)证实了结肠癌病人血清与正常人血清之间微小核糖核酸表达的巨大差异《=0.40)。因此，Solexa技术能筛选出在疾病及正常生理状态下差异表达程度大的一系列血清微小核糖核酸分子，并且这些微小核糖核酸分子可作为检测结肠癌发生的分子标记用于早期诊断结肠癌。实施例3用于诊断结肠癌的血清微小核糖核酸试剂盒的制作用于诊断预测结肠癌的微小核糖核酸试剂盒的制作工艺和操作流程是基于Solexa测序技术，同时结合定量和半定量PCR技术。通过Solexa测序的方法，首先测定正常人和结肠癌病人血清微小核糖核酸表达谱，然后筛选在结肠癌及正常生理状态下表达量和差异程度大的一系列血清微小核糖核酸，作为预测是否发生结肠癌以及诊断病变程度的指标。表4显示与正常人血清相比，结肠癌病人血清中显著变化的微小核糖核酸，可以筛选出一批血清微小核糖核酸作为诊断结肠癌发生的分子标志物。表4结肠癌病人血清与正常人血清相比显著变化的微小核糖核酸<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>诊断结肠癌的血清微小核糖核酸试剂盒包括一批血清微小核糖核酸引物，Taq酶、dNTP等试剂。其中所述血清微小核糖核酸的引物选自结肠癌血清与正常血清相比发生变化的微小核糖核酸中的一种或几种的引物。此试剂盒的使用方式为通过定量和半定量PCR技术的方法测定作为疾病标记物的一类血清微小核糖核酸表达量的变化程度，从而诊断结肠癌发生与否和癌变程度。此试剂盒的价值在于只需要结肠癌血液而不需要其它组织样品。通过Solexa测序技术筛选在结肠癌及正常生理状态下表达量和差异程度大的一系列血清微小核糖核酸，用定量和半定量PCR技术检测微小核糖核酸的变化趋势，再通过该变化趋势预测结肠癌发生的可能性或诊断结肠癌的病理阶段。因此将此试剂盒投入实践，可以增加在早期发现结肠癌的可能，帮助指导诊断和治疗。权利要求1、一种Solexa技术鉴定结肠癌病人血清中微小核糖核酸的方法，其特征是由以下步骤构成(1)收集正常受试者和结肠癌受试者的血清样本；(2)通过Trizol试剂提取血清总RNA；(3)进行PAGE电泳回收17-27ntRNA分子；(4)进行Solexa技术的准备实验，在17-27ntRNA分子两个末端加上接头adapter；(5)小RNA接头分子一端固定在Solexa芯片表面上，并进行“桥式”PCR扩增反应；(6)利用可逆性末端终结反应，通过四种荧光碱基的合成进行测序；(6)数据分析与处理。2、根据权利要求1方法所制备的用于诊断结肠癌的血清微小核糖核酸试剂盒，其特征为-(1)该试剂盒包含测定结肠癌血清微小核糖核酸的工具，包括酶，dNTP及仪器；(2)此试剂盒只需要结肠癌病人血液而不需要其它组织样品；(3)此试剂盒包含结肠癌病人血清与正常人血清相比发生变化的微小核糖核酸中的一种或几种引物；(4)此试剂盒用定量或半定量PCR技术测定作为疾病标记物的一类血清微小核糖核酸表达量的变化程度，从而诊断结肠癌发生与否和癌变程度。3、权利要求2所述的用于诊断结肠癌的血清微小核糖核酸试剂盒或权利要求1中的Solexa技术在诊断和鉴定结肠癌中的应用。全文摘要一种Solexa技术鉴定结肠癌病人血清中微小核糖核酸的方法，属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种研究血清中微小核糖核酸表达的Solexa技术以及Solexa技术在结肠癌诊断中的应用。该方法包括应用Solexa测序方法测定结肠癌受试者的血清微小核糖核酸表达谱。Solexa测序的方法具有检出谱系广、灵敏度高、取材方便、样本易存放等优点，该方法可广泛用于疾病普查等相关工作，改进单一的标记物所难以克服的个体差异所带来的低特异性和低灵敏度，显著提高疾病的临床检出率，成为早期诊断疾病的有效手段。文档编号C12Q1/68GK101298630SQ20081012398公开日2008年11月5日申请日期2008年6月11日优先权日2008年6月11日公开号200810123981.发明者张峻峰,张辰宇,柯曾,媛殷,进王,王可慧,星蔡,郭继刚,熹陈,陈江宁申请人:南京大学被以下专利引用(3),