专利名称：原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种恒温核酸扩增检测方法,特别是一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速 检测方法。
背景技术：
目前，常规的病原菌检测方法(例如，大量增殖菌数、離纯化分离、外部形态结构和生理 生化鉴定以及血清学鉴定等)由于其耗时费力、步骤繁琐等不足之处，已经愈来愈跟不上人魏 致病微生物快速、简易、高特异性的鉴定要求。因此，在分子生物学水平上来研究这醜原菌的 核酸结构和分邻征将对那些难以人工培养和不能人工培养的病原微生物进行正确地鉴定非常适 用，以大大提高对病原菌的检测和研究能力。目前，在病原菌的肝生物学检测方法中，核酸扩 增法是最有效的工具之一。
聚合酶链式反应(PCR)方法是至今使用最广泛的核酸扩增方法，它作为一种简便高效的基 因扩增技术在病原菌检测过程中发自 作用。PCR方法尽管操作起来比较简单易行，扩增产 物在短时间内能够大量聚集，但是操作过程必须有高精密的温度循环装置，从而使得这种强有力 的方法不能在实地广泛应用。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核,列扩增法 (NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。 SH种方法的检测7JC平都不少于10 个拷贝，耗时lh左右就可以将目标核酸扩增至湘似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增 特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便 成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否贝雌确性不够，目前只能是辅助检测手段。 所以，及时将生物駄发展的最新成果鹏于病原微生嫩测，具有重要意义。
DNA环介争恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA， LAMP)克服 以往基因扩增方法的不足，在等温斜牛下能够特异性、高效、快速i舰行核酸的扩增，具有很多 .的i^i性。该方法通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进t f页处理，快速提取被检标本 的DNA或RNA;步骤二特异性引物的制备确定待测标本的耙基因后，取得特异性引物2对， 内引物和夕卜引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、 引物、反应缓冲液与B对DNA聚合酶混合，在63 65'C保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应； 步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温斜牛下高效 地扩增核酸。但是现有駄也有不^处，主要是1、其麟弓卿要求极为苛亥鹏制该方法的广 泛应用；2、为了满足扩增所需要的DNA的量，必须增殖病原菌的数量；但是，对于一，殊的 样品，细菌的增值是很困难的；3、仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不
易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克S隨些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
发明内容
本发明的目的在于解决上述技术问题，Jii共一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检观仿法， 该方法特异性强、灵敏度高、检准率高、鉴定简便。 为达到本发明的目的，采用如下技术方案
本发明的一种原位荧光环介导直温核酸扩增快速检测方法，包括如下步骤
(1) 将细胞悬浮于磷酸缓冲液中，10000-12000ipm离心2-3辦中，去掉上清，然后用磷酸缓 冲液冲洗细胞2-3次，3%多聚甲醛固定10-18h;再将细胞悬浮液滴加到用0.01-0.1 %多聚赖氨酸浸
泡jia干燥的玻板孔中，风干；
(2) 在(1)中得到的固定有细胞的玻板孔中依次加A30-60。/。、 60-80%、 80-100%的乙醇溶 液各放置l-2辦中后倒弃；再加入0.3-0.7mg/ml的用样品预处理液溶解的溶菌酶溶液，放置10-15min 后倒弃r然后加入0.1-0.3pg/ml的蛋白敝，放置5-154Ht后倒弃；最后加入0.5-]mg/ml的RNA酶， 放置15-20分钟后倒弃；
(3) 在(2)中得到的固定有细胞的玻板孔中加入10pmol/nl弓嫩1.5nl，反应缓冲液9.5^11， BWDNA聚合酶0.5^1 (8U)，丰鎌DNA2pl，加水至25nl;，聚酉詰寸层；63-65。C恒温反应l-1.5h;
(4) 在(3)中反应后的玻板孔中加入lmg/ml4,6-联脒-2-苯基U引哚染料，放置10-15分钟， 然后用无菌水漂洗2-3次，每次10-15，，自然干；
(5) 将(4)中得到的玻板孔置于荧光显微镜下观察，观察到细胞发出荧光者为阳性，无荧 光者为阴性。
所述的样品预处理液为20mM pH 8.0的Tris-HCl、 2mM EDTA、 1.2%Triton X-100的混合液。 所述的引物包括两条外引物、两条内引物，其中一条内引物的5、端用荧光素标记。 所述的荧光素为cy3、 FITC、 cy5之一。
所述的反应缓冲液组分为10x聚合酶反应缓冲液lOmMdNTP: 150mMMgSO4=5: 1: 2。 本发明的原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法，具有以下有益效果
(1) 无需增菌检测之前不需要对待检菌进4界咅养；
(2) 高特异性假阳性检观摔小于1%;
(3) 快速、高效扩增扩增在不到1小时即可完成，且产率高；
(4) 灵敏度高在复杂体系中可检领倒单细胞的靶目标；
(5) 实现样品原位检测在不增菌的条件下，直接对样本中的病原微生物进行原位基因扩增；
(6) 鉴定简便M3i荧光显微HlI察细胞是否发荧皿行鉴定。 具体实駄式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方法，但本发明不限于实施例。
实施例l.用本发明的原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法检测副溶血弧菌，按以下步骤进 行
(1) 被检样品的预处理
将待测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000rpm离心2^l中，取上清，上清液依次做10倍稀释度 稀释，^稀释度取lml涂平,行细胞计数;再用10000rpm速度离心2射中沉淀上清中的细胞， 然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3%多聚甲醛固定，固定10h;处理的细胞悬浮液20W滴加到用 0.03X的多聚赖氨酸液浸泡的玻板 L中，空气中自然风干。
(2) 细胞壁fflit性处理
将固定好的细胞分别置于30%， 70%， 90%浓度的乙醇溶液中各处92辦中，进行脱水；再用 0.3mg/ml浓度的溶菌酶溶液处理细胞10min，达到部分,细胞壁多糖的目的，其中溶菌酶用样品 预处理液溶解；然后用0.1pg/ml的蛋白SlK处理细胞5^H中，去除细胞壁以及与DNA结合的蛋白； 最后用0.5mg/mJ的RNA酶处理15射中，除掉细胞中的RNA，减少对DNA扩增的影响。
(3) 环介导等温扩增(LAMP)反应
在200ulPCR管配制反应体系10pmol4U四条弓嫩各加1.5W，反应缓冲液9.5pl, Ry/DNA 聚合酶0.5^1 (8U)，模板DNA2m1，加水至25^1;将配制好的反应混和液滴加至睏定有细胞的玻 板孔中，聚酯封层'，63。C恒温反应lh。 所用引物如下
内引物1: CGCACCAGCTACTCGAAAG; 内引物2: CGGCGAAGAACGTAATGTCT;
夕卜弓|物1: cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGCGACCGATTGGGAATGG; 外引物2: ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGT TCGCCAAAT; 所用反应缓冲液为80^110mM dNTP， 50m1 lOxThermoPol Buffer, 20^1150mMMgS04 ; 所用样品预处理液忽O mM Tris- HC1 [pH 8.0], 2 mM EDT入1.2% Triton X-100;
所用阳性对照副溶血弧菌基因組dna。
(4) 反应结束后，将玻片置于lmg/ml4,6-自-2-苯基吲哚(DAPI)染料中染色10併中，然 后在无菌水中漂洗两次，每次15辦中，自然干。
(5) 将千燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调麟距，打开荧光，在冬鹏中看至微发荧光的 邻胞就是阳性结果，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。 实施例2.用本发明的原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法检湖挱门氏菌，按以下步骤进行
(1)被检样品的预处理 将待测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000ipm离心2射中，取上清，上清液依次做10倍稀释度 稀释，^h稀释度取lml涂平鹏行细胞计数；11000ipm离心3辦中沉淀上清中的细胞，然后用
磷酸缓冲液冲洗细胞3次，3。/。多聚甲醛固定18h;细胞悬浮液20Ml滴加至,多聚赖氨酸处理过的
玻璃板孔中，自然风干。
(2)细胞壁鹏性处理
将固定好的细胞分别置于40%， 60%， 80。/。浓度的乙醇液中各处理1.5min，进行flfejc;用0.5mg/ml 浓度的溶菌酶溶液处理细胞15^H中，达到部分,细胞壁的目的，其中溶菌酶用样品预处理液溶 解；再用0.3^ig/ml的蛋白SlK室温下处理细胞l(^H中，去除细胞壁以及与DNA结合的蛋白；最后用 0.7mg/ml的RNA酶处理18^l中，除掉细胞中的RNA，减少对DNA扩增的影响。 G)环介导等温扩增(LAMP)反应
在200ulPCR管配制反应体系1Opmol/Ml四条引物各力口 1.5pJ，反应缓冲液9.5^L B对DNA聚 合酶0.5W (8U)，模板DNA2m1，加水至25nl;将配制好的反应混和液滴加至睏定有细胞的玻板 孔中，聚酯封层；65。C恒温反应1.5h。 所用引物为
内引物h GTGCAACAGCTACGTGATGA; 内引物2: CTCTATTGCCGGCATCATTA;
外弓|物1: FTTC- CTTAGATCCCCGCATTGTTGATTnTCCGCCACATATTATCGCGAT; 外引物2: GACCATCATGAATGGTCAGCATTTTATTGGCGGTATTTCGGTCTA; 所用反应缓冲液含80^110mM dNTP， 50|il lOxThermoPol Buffer, 150mM MgS04 ; 所用样品预处理液念O mM Tris- HC1 [pH 8.0]， 2 mM EDT入1.2% Triton X-100;
阳性对照为猪霍乱沙门氏菌基因组DNA。
(4) 反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色15射中，然后在无菌水中漂洗3次， 每次10射中，自然干。
(5) 分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞 就是阳性结果，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不至啲细胞即为阴性结果。在荧光显微 镜下最低可以检测到1个细胞，未发现假阳性。
实施例3.用原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法检测大肠杆菌0157，按以下步骤进行
(1) 被检样品的预处理
将待测样品悬浮于磷酸缓冲液中，1000ipm离心2^H中，取上清；上清液依次做10倍稀释度 稀释，每个稀释度取lml涂平板进行细胞计数；12000rpm离心3^Ht沉淀上清中的细胞，然后用 磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3%多聚甲醛固定1611;细脱悬浮液20^U滴加至佣多聚赖氨酸处敏的 玻璃板孔中，自然风千。
(2) 细胞壁鹏性处理
将固定好的细胞分别置于60%, 80%， 100%浓度的乙醇液中各处理1^1中，进行脱水；用
0.7mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞12^H中，达到部分降解细胞壁的目的，其中溶菌酶用样 品预处理液溶解；用0.2^ig/ml的蛋白g室温下处理细胞10^H中，去除细胞壁以及与DNA结合的蛋 白；最后用lmg/ml的RNA酶处理15min，除掉细胞中的RNA，减少对DNA扩增的影响。
(3) 环介导等温扩增(LAMP)反应
在200ulPCR管配制反应体系10pmol4d四种弓卿各力卩1.5Hl，反应缓冲液9.5^1， BwDNA聚 合酶0.5^d (8U)，模板DNA2nl，加水至25^1;将配制好的反应混和液滴加至睏定有细胞的玻板 孔中，聚酯封层；64。C恒温反应Uh。 所用引物为
内引物1: TCTGGCCATTGAGTGCAACA; 内引物2: CAAGCGTACGGCTGGTAAG;
外引物1: cy5- AGCGGCCAGGTAATCAACGTA777TACCACCGGGCTGTATCGTAT; 夕卜弓|物2: CACATCAAGATCACCGGATGTG7777UTACCAGCAGTCTGCTAAGC; 所用反应缓冲液含80nl 10mM dNTP， 50^1 lOxThermoPol Buffer, 150mM MgS04 ; 所用样品预处理液忽O mM Tris- HC1 [pH 8.0], 2 mM EDT入1.2% Triton X-100;
所用阳性对照为0157大肠杆菌基因组DNA。
(4) 反应结束后，将玻片置于lmg/mlDAPI染料中染色12^H中，然后在无菌水中漂洗两次， 每次12^H中，自然干。
(5) 分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在a^中看到激发荧光的细胞 就是阳性结果，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。在荧光显微 镜下最低可以检领接U 1个细胞，未发现假阳性。
权利要求
1、一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法，其特征在于，按如下步骤进行(1)将细胞悬浮于磷酸缓冲液中，10000-12000rpm离心2-3分钟，去掉上清，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞2-3次，3％多聚甲醛固定10-18h；再将细胞悬浮液滴加到用0.01～0.1％多聚赖氨酸浸泡过且干燥的玻板孔中，风干；(2)在(1)中得到的固定有细胞的玻板孔中依次加入30-60％、60-80％、80-100％的乙醇溶液各放置1-2分钟后倒弃；再加入0.3-0.7mg/ml的用样品预处理液溶解的溶菌酶溶液，放置10-15min后倒弃；然后加入0.1-0.3μg/ml的蛋白酶K，放置5-15分钟后倒弃；最后加入0.5-1mg/ml的RNA酶，放置15-20分钟后倒弃；(3)在(2)中得到的固定有细胞的玻板孔中加入10pmol/μl引物1.5μl，反应缓冲液9.5μl，Bst DNA聚合酶0.5μl，模板DNA2μl，加水至25μl，聚酯封层；63-65℃恒温反应1-1.5h；(4)在(3)中反应后的玻板孔中加入1mg/m14，6-联脒-2-苯基吲哚染料，放置10-15分钟，然后用无菌水漂洗2-3次，每次10-15分钟，自然干；(5)将(4)中得到的玻板孔置于荧光显微镜下观察，观察到细胞发出荧光者为阳性，无荧光者为阴性。
2、 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的样品预处理液为20mM pH8.0的 Tris-HCl、 2mMEDTA、 1.2%TritonX-100的混合液。
3、 根据权利要求1所述的检测方法，辦征在于戶腐的引物包括两条外弓嫩和两条内引物， 其中一条内弓卿的5、端用荧光素fei己。
4、 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的荧光素为cy3、 FITC、 cy5之一。
5、 根据权利要求1戶腿的检测方法，其特征在于所述的反应缓冲液组分为10x聚合酶反应 缓冲液lOmMdNTP: 150mMMgSO4=5: 1: 2。
全文摘要
本发明公开了一种原位荧光环介导恒温核酸扩增快速检测方法，包括如下步骤将细胞用3％多聚甲醛固定10-18h；再将细胞悬浮液滴加到用0.01-0.1％多聚赖氨酸浸泡过且风干的玻板孔中，风干；在固定有细胞的玻板孔中依次加入乙醇溶液、溶菌酶溶液、蛋白酶K及RNA酶处理；将配制好的核酸扩增反应物滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；63-65℃恒温反应；最后加1mg/ml4，6-联脒-2-苯基吲哚染料，放置于荧光显微镜下观察，观察到细胞发出荧光者为阳性，无荧光者为阴性。本发明的原位荧光环介导恒温基因扩增快速检测方法无需增菌、特异性高、快速、灵敏度高，可以实现样品原位检测并且鉴定简便。
文档编号C12Q1/68GK101173312SQ20071003090
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月18日 优先权日2007年10月18日
发明者琳 李, 丽 王, 磊 石, 耿予欢, 肖增璜, 曦 鲁 申请人:华南理工大学