专利名称：亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及微生物检测试剂与方法，具体涉及一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒 及方法。
背景技术：
亚历山大藻属的部分产毒藻种是引起有害藻华发生的主要原因，其代谢产生的麻痹性贝类毒
素(PST)是一种神经麻痹剂，这种毒素能够富集于贝类或者鱼类体中，i!3i食物链，直接威胁人 类健康。因此，亟需开MX寸产PST毒素有害藻种的检测，提高检测灵驗，从而在源头上杜绝藻 毒素对公众健康、7jC环境及自然资源的危害。公认的藻种检领仿法是通过光学或者电子显微镜来 观察藻的形态特征，但是，这种检测手段受仪器限制难以满足长期监测的需求，并且藻的表型特 征常常会受到环境因素和培养条件的影响，使得相似或相近藻种在形态上难以区分。由于藻种在 基因7K平上存在差异，使得分子生物学方法成为有效的检测手段。
目前，基于PCR的方法、荧光原位杂交法、限制性片段长度多态性分析以及免疫学技术等已
经有报道用于有毒藻检测研究。这對开究手段虽然在一定禾號上显著提高了检测灵敏度和特异性， 但是检测过程中需要高精密的仪器，纖使得检测手段变得复杂和耗费。所以，不能满足实地快
速检测的需要。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核,列扩增法(NASBA)、 自序列复制法。SR)和链置换复制法(SDA)。 SH种方法的检泖冰平都不少于10个拷贝，耗时 1小时左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序歹啲扩增特异性不强， 使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但 要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生 物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，， LAMP)克服
以往基因扩增方法的不足，在等温剝牛下肖鹆特异性、高效、快速i腿行核酸的扩增，具有很多 的优越'性，见文献Notomi T， Okayama H, Masubuchi H， Yonekawa T， Watanabe IQ Amino N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63 。该方法 通常是按如下步骤进行步骤一、对被检标本进纟 f页处理，快速提取被检标本的DNA或RNA; 步骤二、特异性引物的制备确定待测标本的耙基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物 各一对;.步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应将经前处理的样品、弓嫩、反应缓冲 液与BW DNA聚合酶混合，在63 65'C保温0.5至1.5小时进行循环链置换反应；步骤四、分析 判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在，割牛下高效地扩增核酸， 但是现有技术也有不足之处，主要是1.其特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.仅
凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发
展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行鹏。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂M 方法。
为达到本发明的目的，采用以下技术方案-
本发明的一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒，其试剂包括-——引物混合液四条引物浓度均为10pmol4d，引物序列如SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQID N0.3、 SEQIDN0.4; ——B对DNA聚合酶浓度为8U/^1;
-反应液lOmMdNTP: 10xThermoPol反应缓冲液150mMMgSO4=8: 5: 2;
——#品预处理液20mMTris-HCl (pH8.0) ， 2mMEDTA， 1.2% TritonX-100; ——显色剂荧光染料1XSYBR Green I。
(6)阳性对照为微小亚历山大藻基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。 用上述试剂盒检测亚历山大藻的方、跑括以下步膝
(1) 亚历山大藻基因组DNA提M:程TO夜培养的增菌液于离心管中，lOOOrpm离心2 分钟，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所辯菌体混合均匀；沸水中煮10射中后立 即置于冰上冷却10射中；10000—12000rpm离心2射中，上清即可作为待用的模板DNA;其中增 菌液与样品预处理液的用量比为5: 8;
(2) 恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应混合液引物混合物1,5m1，反应液5.5pl， B对DNA聚合酶0.5^1，模板DNA2W，加水至11.5pJ;设置阳',照反应时，用微小亚历山大藻 基因组DNA替代待检亚历山大藻基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含,的反应混合液 替代待检亚历山大藻基因组DNA;将配制好反应混合液的PCR管于65。C反应1.5小时；
(3) 分析判断反应产物结果在(2)中得到产物中加入2.5^1荧光染料SYBR Green I，混 匀，静置5min;若显现纟絶则为阳性，橙色则为阴性。
本发明的一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂M方法有以下有益效果 高特异性:本发明根据亚历山大藻核糖体DNA设计了四鎌异性引物引物序列如SEQIDNO.l、 SEQIDN0.2、 SEQDDN0.3、 SEQIDN0.4;
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断耙标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9%， 假阳性率小于0.1%;
2、 快速、高效扩增扩增在不到1小时即可完成，且产率高；
3、 灵敏度高用于病原微生物的检测和传染病的诊断中，对细菌类微生物最低检测极限达到 10CFU/ml，标本的检出率达到99%;
4、 鉴定简便通过剛IM察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。
具体实 式
按下列配方制备亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒
——弓l物混合液四条弓l物浓度均为lOpmol/pl,弓卿序列如SEQ ID NO. 1 、 SEQ ID N0.2、 SEQ ID
N0.3、 SEQIDN0.4;
——BrfDNA聚合酶浓度为8U4U;
——反应液80pll0mMdNTP， 50(i lOxThermoPol反应缓冲液，20(al 150mMMgSO4。 ——#品预处理液20mMTris-HCl (pH8.0) ， 2mMEDTA， 1.2%TritonX-100。 ——显色齐IJ:荧光染料1XSYBR Green I。
——阳'M照为微小亚历山大藻基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。 用上述试剂盒按以下方法对亚历山大,行检测
1、 亚历山大藻基因组DNA简易提取过程
(1) 取50pl过夜培养的增菌液于离心管中，1000ipm离心2辦中，去上清；
(2) 加入80^1样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
(3) 沸水中煮10射中后立即置于冰上冷却10射中；
(4) 10000ipm离心2^H中，上清即可作为待用的模板DNA。
2、 环介导恒温扩增(LAMP)反应
(1) 在200ulPCR管配制反应体系引物混合物1.5^1，反应液5.75^1， BrfDNA聚合酶0.5^1， 模板DNA2pl，加水至11.5m1;设置阳性对照反应时，用微小亚历山大藻基因组dna替代待检亚 历山大藻基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含模板的反应混合液替代待检亚历山大藻基因 组DNA;
(2) 将配制好反应混合液的PCR管于65。C反应1.5小时。
3、 分析判断反应产物结果
在反应产物中加入2.5nl荧光染料(SYBRGreen 1)，混匀，静置5min。若显现乡絶则为阳性， 橙色则为阴性。阴性对照为橙色，阴14X寸照为绿色。
引物序列表 SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 丽，王 磊，石 琳,李
<120>亚历山大藻恒温基因扩增'腿检测试剂M方法
<130> Notomi T， Okayama H> Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal ampl迅cation of DNA ， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Alexandrium
<400> 1
tgcagggato agtogtac 18
SEQUENCE LISTING <110〉华南理工大学
磊，石 琳，李
<120>亚历山大藻直温基因扩增快速检测试剂M方法
< 130> Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T， Watanabe K Amino
N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA ， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1
<170> Patentln version 3.4
〈10> 1
<211> 20
《12> DNA
<213〉 Alexandrium
<400> 1
agatoatcca gtgttgtacg 20
SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 丽，王 磊，石 琳,李
<120> 亚历山大藻恒温基因扩增^t检测试剂M方法
< 13 0> Notomi T, Okayama H Masubuchi H> Yonekawa T, Watanabe K> Amino
N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA, Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160> 1<170> Patentln version 3.4
<210> 1
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<212> DNA
<213> Alexandrium
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gtcag^agg ttccac啤cgttttaato gccattcgtt gactac 46
SEQUENCE LISTING
<110>华南理工大学 丽，王 磊，石 琳,.李
<120>亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂M方法
<130> Notomi T， Okayama H， Masubuchi H, Yonekawa T， Watanabe K Amino N， Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA ， Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63.
<160〉 1
<170> Patentln version 3.4
《0> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Alexandriumtctgtggcaa gagcgatgtt ttttccctct gtatttgccg aa 4权利要求
1、一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括——引物混合液四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4；——Bst DNA聚合酶浓度为8U/μl；——反应夜10mM dNTP10×ThermoPol反应缓冲液150mM MgSO4＝8∶5∶2；——样品预处理液20 mM Tris-HCl(pH 8.0)，2 mM EDTA，1.2％Triton X-100；——显色剂荧光染料1×SYBR Green I；——阳性对照为微小亚历山大藻基因组DNA，阴性对照为不含模板的反应混合液。
2、 一种用权禾腰求l所述的试剂維测亚历山大藻的方法，其特征在于，包括以下步骤(1) 待检亚历山大藻基因组DNA提M:程取过夜培养的增菌液于离心管中，1000rpm离 心2辦中，去上清；加入样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；沸水中煮10射中 后立即置于冰上冷却10辦中；10000—12000rpm离心2射中，上清即可作为待检的亚历山大藻DNA;其中增菌液与样品预处理液的用量比为5: 8;(2) 恒温基因扩增反应在200ulPCR管配制反应混合液引物混合物1.5nl，反应液5.75^， B对DNA聚合酶0.5W，待检亚历山大藻基因组DNA2pl，加水至设置阳性对照反应时， 用微小亚历山大藻基因组DNA替代待检亚历山大藻基因组DNA，设置阴性对照反应时，用不含 模板的反应混合液#1戈待检亚历山大藻基因组DNA;将配串收子反应混合液的PCR管于65°C反应 1.5小时；(3) 分析判断反应产物结果在(2)中得到产物中加入2.5^1荧光染料SYBR Green I,混 匀，静置5min;若显现纟絶则为阳性，跪则为阴性。
全文摘要
本发明公开了一种亚历山大藻恒温基因扩增快速检测试剂盒及方法，试剂盒包括引物混合液、Bst DNA聚合酶、反应液、样品预处理液、显色剂、阳性对照及阴性对照，其中引物序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。利用该试剂盒通过提取亚历山大藻基因组DNA、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对其高特异性、快速、高灵敏度、简便的检测。
文档编号C12Q1/68GK101168768SQ20071003096
公开日2008年4月30日 申请日期2007年10月19日 优先权日2007年10月19日
发明者芳 刘, 琳 李, 丽 王, 磊 石, 耿予欢 申请人:华南理工大学