用于现场核酸扩增和检测的方法和设备的制造方法
【专利摘要】本文提供了用于现场核酸扩增和检测的方法和设备。本发明的一个实施方式包括完全集成的、样品到结果式的分子诊断仪器，其任选地可以以多重方式使用来检测多种感兴趣的靶核酸序列，并且任选地可以构造成在一次使用后丢弃。该仪器优选采用等温核酸扩增技术(如环介导等温扩增(LAMP))来降低与核酸扩增相关的仪器要求。靶扩增的检测可以例如通过检测添加到扩增反应中的染料的颜色偏移或荧光来实现。这种检测可以由操作者目视进行或者可以采用成像技术(例如分光光度成像)实现。
【专利说明】用于现场核酸扩増和检测的方法和设备
[0001 ] 相关申请的引用
[0002]本申请要求2013年10月22日提交的美国专利申请第61/894,392号和2014年4月25日提交的美国专利申请第14/262,683号的优先权和申请日权益，此二者全文在此援引加入。
[0003]援引加入
[0004]本说明书中提到的所有出版物和专利申请都在此援引加入，达到就像各个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出被援引加入的相同程度。
技术领域
[0005]本发明涉及用于核酸扩增和检测的方法和设备。更具体地，本发明涉及用于现场(point-of-care)核酸扩增和检测的方法和设备。
[0006]发明背景
[0007]聚合酶链式反应(PCR)被认为是核酸扩增和检测的金标准，因为PCR的特异性和灵敏度比类似的酶联免疫吸附试验(“ELISA”)测试的要高得多。然而，PCR系统通常较为昂贵并且需要非常干净的样品。现场(POC)PCR系统通常不是完全的一次性的，不适宜不熟练的人员使用，需要相当的能力和/或含有复杂的处理和读出。因此，PCR传统上限制于资源丰富的、集中式的实验室环境。
[0008]鉴于前述情况，提供克服此前已知的方法和设备的缺陷的用于现场核酸扩增和检测的方法和设备将是人们所希望的。
【附图说明】
[0009]本发明的若干个实施方式在结合随附附图考虑以下详细描述后将是明显的，在所述附图中通篇相似引用符号指代相似部件，并且其中:
[0010]图1是样品收集器的一个实施方式的示意图；
[0011]图2A-2C是用于制备样品和将样品从图1的样品收集器转移到现场核酸扩增和检测设备的设备和方法的等距视图和侧视图；
[0012]图3A和3B是用于制备样品和将样品从图1的样品收集器转移到现场核酸扩增和检测设备的替代性设备和方法的侧视图和等距视图；
[0013]图4A-4D是用于制备样品和将样品从图1的样品收集器转移到现场核酸扩增和检测设备的另外的替代性设备和方法的侧截面视图和等距视图；
[0014]图5是图2-4的现场核酸扩增和检测设备的部件分解视图；
[0015]图6是图2-5的现场核酸扩增和检测设备的通道和室元件的底视图；
[0016]图7A是与加热元件热连通的图2-6的现场核酸扩增和检测设备的等距视图，而图7B是与图7A的设备和方法一起使用的任选的检测传感器的等距视图；
[0017]图8A-8E是图2-7的用于现场核酸扩增和检测的方法和设备的替代性实施方式的等距视图、顶视图、底视图和侧截面视图；
[0018]图9A-9J是用于现场核酸扩增和检测的方法和设备的另一替代性实施方式的等距视图、顶视图、底视图、装配视图、侧截面详细视图和半透明详细等距视图；
[0019]图10A-10G是用于现场核酸扩增和检测的方法和设备的另一替代性实施方式的等距顶视图、等距底视图、等距详细视图、半透明详细视图和侧截面详细视图；和
[0020]图11A-11J是用于现场核酸扩增和检测的方法和设备的又一替代性实施方式的侧视图、侧截面视图、等距视图和半透明等距视图。
【具体实施方式】
[0021]虽然本公开是详细且准确的以使得本领域技术人员能够实施所公开的技术，但本文所公开的物理实施方式仅仅示例了本发明的各个方面，其可以以其他特定结构实施。虽然描述了优选实施方式，但可以改变细节而不背离由权利要求限定的本发明。
[0022]本发明涉及用于核酸扩增和检测的方法和设备。更具体地，本发明涉及用于现场核酸扩增和检测的方法和设备。该设备和方法任选地可以以多重方式(multiplexedfash1n)使用来检测多种感兴趣的靶核酸序列(例如，检测至少两种感兴趣的靶核酸序列)，并且该设备任选地可以构造成在一次使用后丢弃。
[0023]该仪器优选采用等温核酸扩增技术(如环介导等温扩增(“LAMP”))来降低与核酸扩增相关的仪器要求。靶扩增的检测可以例如通过检测添加到扩增反应中的一种或多种染料(如羟基萘酚蓝、Picogreen和/或SYBR绿)的颜色偏移和/或荧光，或者通过浊度变化来实现。这样的比色检测、荧光检测和/或浊度检测可以由操作者目视进行和/或可以采用成像技术(如分光光度成像和/或焚光成像)实现，如下所述。
[0024]图1说明了用于收集核酸样品S的样品收集器10(本身已知)的一个实施方式。样品收集器10可以例如包含海绵、泡沫或拭子(swab)。样品收集器10可以例如由惰性聚合物制造。各种样品基质一一包括但不限于食物、尿、唾液、黏液、排泄物、血液、精液、组织、细胞、DNA、RNA、蛋白质、植物物质、动物物质、液体、溶液、固体、气体和其他样品基质——可以作为样品S沉积到样品收集器1上。
[0025]为了用样品收集器10收集样品S，样品收集器可以例如浸入或置入感兴趣的一种或多种样品基质中。在使用样品收集器10的一个方法中，样品收集器可以置于人嘴中一段时间以收集唾液样品S。另外地或可选地，一滴或多滴的感兴趣的一种或多种样品基质可以例如置于或沉积到样品收集器上。作为又一个替代性方案，样品收集器10可以例如擦拭或抹过感兴趣的一个或多个样品基质或表面。
[0026]在收集样品S后，该样品可以从样品收集器10转移到现场核酸扩增和检测设备100。任选地，该样品可以在转移之前、在转移过程中或在转移之后来进行制备，例如通过将样品S与裂解性化学物质流体连通。样品收集器10任选地可以包含制备样品S的裂解性化学物质。另外地或可选地，样品S可以通过热处理进行制备。例如，样品S可以加热到高于等温扩增所需温度的温度，例如，高于环介导等温扩增(“LAMP”)所需的温度。在一些实施方式中，样品S可以包含全血，其可以例如在约99°C下热处理例如约10分钟以实现样品制备。另外地或可选地，可使用本身已知的其他制备方法。在一些实施方式中，样品S不需要进行制备。在一些实施方式中，样品S与水、缓冲剂和/或染料溶液混合可能足以制备样品用于核酸扩增。
[0027]图2说明了用于将样品S从样品收集器10转移到现场核酸扩增和检测设备100的方法和设备的一个实施方式。如图2A中所见，样品收集器10可以置于具有鲁尔锁(luer lock)22的样品收集器容纳元件20内。容纳元件20包括样品收集器10可以置于其中的内腔或隔室。如图2B中所见，在样品收集器10置于容纳元件20内之后，具有鲁尔锁26的帽24可以附接到样品收集器容纳元件20。容纳元件20和样品收集器10然后可以通过使帽24的(凸或册)鲁尔锁26与注射器30的(凹或凸)鲁尔锁32配合来附接到注射器30。
[0028]如图2C中所见，注射器30和具有样品收集器10的容纳元件20可以通过使容纳元件20的(凸或凹)鲁尔锁22与设备100的(凹或凸)鲁尔锁102配合而与现场核酸扩增和检测设备100偶联。注射器30可以含有液体L(例如水、缓冲液和/或比色或其他染料的溶液)来通过按下柱塞34来将样品S从样品收集器10洗脱到设备100中。设备100的鲁尔锁102(和/或用于递送样品S的注射器或其他替代性递送装置)任选地可以包括在核酸扩增和检测过程中防止回流的单向阀。
[0029]图3说明了用于将样品S从样品收集器10转移到设备100的替代性方法和设备。如图3A中所见，容纳元件20的鲁尔锁22可以与第二注射器40的鲁尔锁42耦合。可以按下注射器30的柱塞34来将液体L和样品S从样品收集器10洗脱到第二注射器40中。在样品转移到设备100之前，将液体L和样品S洗脱到第二注射器40中可以增强液体与样品在转移到设备100之前的混合。此外，样品S任选地可以多次地收集和/或洗脱到第二注射器40中，之后转移到设备100。
[0030]如图3B中所见，在样品S和液体L收集到第二注射器40内后，第二注射器40可以与注射器30、容纳元件20和样品收集器10脱离。第二注射器40然后可以通过使鲁尔锁42与鲁尔锁102配合来与设备100偶联。按下柱塞44迫使样品S和液体L进入设备100中。
[0031]图4说明了用于将样品S从样品收集器10转移到设备100的另外的替代性方法和设备。如图4A中所见，含有样品S的样品收集器10可以通过临时将柱塞34与注射器脱离来直接置于注射器30内。任选地，液体L可以与含有样品S的样品收集器10—起置于注射器30内，虽然应理解液体L或者可以省略。在样品收集器10置于注射器30内之后，柱塞34可以重新附接到注射器上，如图4B中那样。注射器30然后可以通过使鲁尔锁32与鲁尔锁102配合而与设备100偶联，如图4C中那样。如图4D中那样，按下柱塞34使样品收集器10压缩并使样品S压出到设备100中。
[0032]现参照图5，描述用于现场核酸扩增和检测的完全集成整合的样品到结果式(sample-to-answer)的分子诊断设备100的第一实施方式。设备100包括连接到通道和室元件110的鲁尔锁102。元件110可以例如由聚丙烯制造。
[0033]通道盖104例如通过粘合剂或螺钉连接到元件110的底部，而室盖106例如通过粘合剂或螺钉连接到元件110的顶部。盖104和106可以例如包括粘合剂膜或带。室盖106(和任选的通道盖104)优选是半透明或透明的，以便于目视检查元件110的反应室112的内容物。设备100也可以包括具有空气过滤器122的顶盖120以及与元件110的室112对齐的室窗124。在一些实施方式中，各个室112可以具有小于约100微升的体积，例如，约30微升左右的体积。
[0034]如图5和6中所见，元件110的反应室112通过(优选等长度的)微流通道114连接到入口 116。样品S被收集并例如通过如此前就图2-4所述的按下注射器柱塞而经由鲁尔锁102压出到设备100中。样品S例如通过连续按下注射器柱塞的连续压出迫使样品S从入口 116经由微流通道114进入室112中。各个室112含有用于进行核酸扩增的试剂130。试剂130可以例如包含酶和主混合物(master mix)。在通过LAMP进行核酸扩增时，酶可以例如包含Bst DNA聚合酶、Bst2.0WarmStart DNA聚合酶和/SBsm DNA聚合酶(和任选的反转录酶)。主混合物可以例如包含引物、dNTP、MgS04、甜菜碱和/或赋形剂(例如甘露糖醇、海藻糖和/或糊精)。试剂130也可以包含水、TE缓冲剂、等温缓冲剂和/或其他缓冲剂，其任选地可以例如在递送样品S之前、递送样品S过程中和/或递送样品S之后例如作为液体L经由微流通道114递送到室 112。
[0035]试剂130还可包含一种或多种染料以利于检测核酸扩增，例如羟基萘酚(“HNB”)蓝。靶扩增的检测可以例如通过检测在扩增子存在下例如由于游离镁(Mg2+)浓度在LAMP扩增过程中的改变而产生的比色染料中的颜色偏移来实现。这种比色检测可以由操作者目视进行或者可以采用分光光度成像实现，如下所述。除使用比色染料的比色扩增检测之外或者作为使用比色染料的比色扩增检测的替代方式，荧光染料(如Picogreen或SYBR绿)可以用于通过荧光检测扩增。
[0036]—种或多种试剂130优选是冻干的，例如，以利于长期储存。另外地或可选地，一种或多种试剂在核酸扩增之前可以临时性地与一种或多种其他试剂隔离。这种临时性试剂隔离可以有利于试剂的长期储存和/或可以预先阻止试剂混合(并由此防止核酸扩增)直到期望试剂混合，例如直到试剂已经暴露于样品S。例如，酶可以与主混合物隔离。
[0037]在一些实施方式中，一种或多种试剂130可以临时性隔离在一个或多个临时性隔离容器内。在一些实施方式中，临时性隔离容器可以例如包含一种或多种热包装材料，所述热包装材料构造成当加热时(例如在核酸扩增过程中)熔融、变成多孔性的或者以其他方式释放隔离的试剂130。热包装材料可以例如包含聚己内酯和/或相变材料如石蜡或蜡。在一些实施方式中，所述临时性隔离容器可以包括一个或多个泡罩包装或其他容器如胶帽(gelcap )，其可以刺穿或以其他方式开放以释放隔离的试剂130。在临时性隔离容器包括胶帽时，它们任选地可通过在刺穿之外或者作为刺穿的替代方式的水解来打开。
[0038]在样品S经由微流通道114递送到室112时，各个含试剂的室112构造成扩增感兴趣的核酸靶序列(如果包含在样品S中的话)。不同的室112任选地可以采用不同的引物以有利于在不同的室中扩增和检测不同的感兴趣的靶序列(例如，利于多重核酸扩增和检测)。室112的一部分可以充当阳性对照(例如，可以预先加载预期在核酸扩增过程中扩增的感兴趣的一种或多种靶核酸序列)。另外地或可选地，室112的一部分可以充当阴性对照(例如，可以包含试剂130但可以不连接到微流通道114，使得它们不含样品S)。
[0039]在样品S递送到室112后，可以加热(例如等温加热)室以扩增感兴趣的一种或多种靶核酸序列。在通过LAMP进行等温核酸扩增时，室112的内容物可以在约60 °C -65 °C范围内加热约5-70分钟。如图7A中所见，室112的内容物可以通过与设备100热耦合的加热元件200加热。这样的加热可以采用包括(但不限于)电技术、化学技术和/或电化学技术的多种技术中的任一种来实现。加热元件200可以例如包括连接到电源(如一个或多个电池或壁装插座连接件)的电阻加热器，以及任选的用于电阻加热所述室112的内容物的温度控制器。另外地或可选地，加热元件200可以包括金刚石/钨加热器、感应加热器、化学加热器(例如，放热化学加热器，如过饱和乙酸钠加热器、纤维素/铁/水/活性碳/蛭石/盐加热器、氧化铁加热器、铁/镁盐加热器、催化燃烧器、燃料电池加热器等)。加热元件200可以是可重复使用的，或者可以构造成在一次使用后丢弃。任选地，加热元件200可以整体地连接到设备100。加热元件200可以是完全自动化的，或者可以包括例如允许用户设定目标温度和加热持续时间的控制。任选地，加热元件200可以包含相变材料(如石蜡)以使期望的温度维持延长的时间段。
[0040]如前所述，靶扩增的检测任选地可以通过检测在扩增子存在下一种或多种染料的颜色偏移(即波长偏移)和/或荧光(即强度偏移)来实现。这样的比色检测和/或荧光检测可以由操作者目视进行和/或可以采用成像技术(如分光光度成像和/或荧光成像)实现。在图7B的实施方式中，传感器300 (如分光光度CMOS或CXD成像传感器300)靠近室112以检测颜色偏移、荧光、浊度或指示靶核酸序列扩增的一些其他变化。室盖106(参见图5)优选是透明的以于利检测反应室内的变化。在一些实施方式中，传感器300可以集成连接到元件110并且可以覆盖室112，使得室盖106成为不必要。
[0041]传感器300任选地可以包含涂层，如铟锡氧化物(“ΙΤ0”)涂层，其可以在加热元件200之外或者作为加热元件200的替代使用，以电阻加热各个室112的内容物而实现靶核酸扩增。涂层可以置于室112附近。如前所述，在通过LAMP进行等温扩增时，室112的内容物可以在约60°C_65°C范围内加热约5-70分钟。
[0042]成像传感器300可以在等温加热之前测量试剂130和样品S的基线颜色和等温加热之后试剂的最终颜色(例如，在等温加热之后)。由于各个反应室112内的试剂130可以例如包含在靶核酸序列扩增时颜色例如从紫色偏移到蓝色的比色(或荧光)染料，该室内任何这样的颜色偏移都可以通过成像传感器300作为基线颜色与最终颜色之间的差异检测到，并且这种差异可以指示靶扩增。如图7B中所见，任选的数字读出器或显示器310可以将检测结果(和/或指令)输出给用户，消除任何检测含义不清的风险。虽然图7B的实施方式说明性地通过分光光度成像实现了比色或荧光检测，但应理解这种比色或荧光检测可以另外地或可选地由操作者目视进行。
[0043]加热元件200和/或传感器300可以包括用于控制加热元件和/或传感器的运行、用于通过加热所述室112来控制核酸扩增、用于比较用传感器300取得的基线和最终颜色测量结果来确定是否已经发生扩增、和/或用于控制指令或检测结果通过显示器310的显示的逻辑芯片。电线和/或电路板可以将逻辑芯片连接到加热元件200、传感器300和/或电源。电源可以例如包括一个或多个电池或壁装插座连接件。
[0044]现参照图8，描述了设备100的替代性实施方式。在图8的实施方式中，元件110’包括四个室112而非十六个(如对于本领域技术人员来说明显的，可以提供任意数量的室112)。元件110’包括用于将空气从室排到大气的与各个室112的顶部流体连通的排出通道118。微流通道114将样品S递送到各个室112的底部，并且排出通道118将溢出物从各个室的顶部经由透气膜或单向阀119排出到设备100外。图8A是设备100的等距视图。在图SB中所见的元件110’的顶视图中，排出通道118与室112的顶部的流体连通是可见的。在图SC中所见的元件110’的底视图中，微流通道114从入口 116到室112的延伸是可见的，膜或阀119也是如此。图8D的侧截面视图是经鲁尔锁102和排出通道118的出口截取的。图SE的侧截面视图是经室112截取的，并且显示了微流通道114与室的底部的流体连通以及排出通道118与室的顶部的流体连通。
[0045]图9提供了包括元件110”的设备100的另一个替代性实施方式。图9A提供了设备100的等距视图，图9B显示了移除室盖106的设备的元件110”的顶视图，并且图9C显示了移除通道盖104’的元件110”的底视图。虽然图8中显示的设备100的实施方式包括将空气从室112经由排出通道118和元件110 ’的膜或阀119排放到大气，但图9中显示的设备100的实施方式将空气从室112经由排出通道118’排放到元件110”的一个或多个溢出物室(参见图9C)，而非排放到大气。因此，图9的设备100是完全封闭的。溢出物室125优选地尺寸设计为在核酸扩增过程中将溢出物室中的压力增加限制为小于约5-10psi。
[0046]如图9C中最有利地见到的，元件110”还包括防回流阀140，其防止室112之间通过经由微流通道114’的回流的交叉污染。此外，如图9B中最有利地见到的，元件110”包括沿着室112与溢出物室125之间的排出通道118安置的流控制介质150，所述流控制介质允许空气或其他气体从室112排出，但不允许流体从室112排出，由此确保样品S在所有室112中等同地填充，同时释放过度的压力。
[0047 ]图9的元件110”具有的微流通道114 ’比图8的元件110 ’的微流通道114更短。较短的微流通道减少了样品S必须行进以到达室112的预充体积(priming volume)。元件110”可具有近似20-50微升的预充体积。与前述微流通道114相比，微流通道114’沿着元件110”的顶部和底部二者延伸，以及穿过元件110”延伸。微流通道114’的迂回路径在下文中更详细的描述。
[0048]在图9的实施方式中，通道盖104’包括层合体160，所述层合体除覆盖位于元件110”底部上的微流通道114’的一部分之外，还与防回流阀140结合起作用以防止室112之间的交叉污染。在图9D的部件分解视图中所见的一个实施方式中，层合体160包括双面粘合剂层162、弹性体层166和任选的单面粘合剂背衬层168。元件110”包括任选的对准柱(registrat1n post) 111以使层合体160的层在层合体附接到元件110”的过程中对齐。层162包括与对准柱111对齐的任选的对准切口( cutout) 163。类似地，层166包括任选的对准切口 167，而层168包括任选的对准切口 169。层162还包括围绕防回流阀140的阀切口 164，而层168包括阀切口 170。双面粘合剂层162附接到元件110”并附接到弹性体层166。任选地，单面粘合剂背衬层168可以连接到弹性体层166以降低层合体160分层的风险。图9E是附接有通道盖104’的设备100的底视图。
[0049]现结合图9A-9E参照图9F和9G，描述了使用图9中显示的设备100的实施方式的方法。如图9F中所见，注射器30(或其他任何样品转移装置，例如前述注射器40或前述具有容纳元件20的注射器30)通过使鲁尔锁32与鲁尔锁102配合来与设备100偶联。注射器30使样品S(和任选的液体L)经由入口 116压出到设备100中。样品S沿着元件110”的底部在微流通道114’内行进(结合图9C参见图9F)。微流通道然后通过元件110”并将样品S带到元件110”的顶部，之后分支成多个微流通道114’(结合图9B参见图9F)。微流通道114’然后经由元件110”往回延伸并将样品S递送到防回流阀140。通过注射器30施加的压力导致层合体160的弹性体层166局部地和临时性地在紧邻阀140处偏转，由此允许样品S通过(结合图9C参见图9G)。在样品S通过后，防回流阀140重新密封以防止样品S回流并由此防止室112的交叉污染。如结合图9C的图9G中最有利地见到的，微流通道114’将已经通过阀140的样品S带回到元件110”的顶部并带到室112中。室112包含试剂130，例如，冻干试剂130。
[0050]排出通道118’从室112延伸出以将空气A从室112排放到溢出物室125(结合图9B和9C参见图9G)。流控制介质150位于在室112与溢出物室125之间的通道118’内。流控制介质150可以例如包含允许空气通过但不允许流体通过的小孔疏水性材料。在空气通过流控制介质150后，其在排出通道118’内从元件110”的顶部经由该元件行进到溢出物室125。
[0051 ]正如设备100的其他所有实施方式一样，图9中显示的设备100的实施方式可以包括加热元件或者与加热元件(例如图7的加热元件200)偶联以通过试剂130扩增感兴趣的一种或多种靶核酸序列(当存在于样品S中时)。靶序列扩增可以由操作者目视检测，例如通过目视检测视觉指示剂，如比色染料中的颜色偏移或者浊度变化，或者经由例如通过视觉指示剂(颜色偏移、荧光、浊度变化等)的检测来检测扩增的传感器(如图7B的传感器300)来自动检测。图9中显示的设备100的实施方式示意性地包括空气溢出物室125和防回流阀140。应理解设备可选地可仅包括防回流阀或仅包括溢出物室。
[0052]现参照图9H-9J，设备100任选地可以包括容纳设备100的外壳180。外壳180可以包括具有凹陷184的空腔182，所述凹陷构造成接纳元件110”的防回流阀140。加热元件200也可以安置在空腔182内在室112附近，以加热室112的内容物。外壳180还包括盖186，其具有利于室112的可视化的室切口 188，和具有提供至鲁尔锁102的通路的鲁尔锁切口 190。盖186例如通过螺钉或压入配合(press fit)稳固地附接到内腔182，以与安置在其中的设备100的其他组件形成外壳180。
[0053]图10提供了包括元件110”’的设备100的另一个替代性实施方式。图10中显示的设备100的实施方式包括防回流锁定阀200，其构造成使元件110”，的微流通道114”锁定在允许流动经过通道114”的开放位置或者防止室112之间经由通道114”的回流和交叉污染的关闭位置中。这样的通道锁定可以如所期望形成为可逆或不可逆的。图1OA提供了设备100的等距顶视图，而图1OB提供了设备的等距底视图。图1OC提供了防回流锁定阀200的等距详细视图。为了清楚起见，室盖106和通道盖104未在图10中显示。然而，应理解它们可以如前文的设备实施方式所描述的提供。
[0054]如图1OA和1B中所见，防回流锁定阀200构造成置于元件110” ’的空位202中，以通过在空位202中相对于元件110” ’滑动锁定阀200而使通道114”如所期望的锁定在开放(SP，使能够流动)或关闭(即，阻断流动)位置中。如图1OC中所见，内腔230通过防回流锁定阀200并且可以选择性地与通道114”对齐或不对齐以分别解锁和锁定通道。锁定阀200可以例如包括具有弹性体包模(overmold)220的相对坚硬或刚性的基底210。弹性体包模220可以包括O形环元件222a和222b，其被构造成产生对元件110”’的液密密封。O形环元件222a与通过锁定通道114”来防止室112之间的交叉污染的防回流锁定阀200的锁定构型相关联。O形环元件222b与内腔230同心地对齐并且与允许经过通道114”的流体流动的防回流锁定阀200的解锁构型相关联。在锁定阀200的替代性实施方式(未显示)中，弹性体包模220可以被省略，并且O形环元件222a和/或222b可以形成或直接附接到基底210。锁定阀200优选包括在使用过程中利于操纵锁定阀的增大的末端部240(即，可以由用户握持以将锁定阀从解锁构型滑动到锁定构型，反之亦然)。
[0055]图1OD和1E是说明锁定阀200的致动的半透明详细视图。如图1OD中所见，通道114”可以通过使锁定阀200定位在元件110”’的空位202内使得内腔230与微流通道114”对齐来置于解锁构型中。任选地，锁定阀200和/或空位202可以被润滑以利于锁相对于空位的滑动。在该解锁构型中，O形环元件222b在通道114”周边形成流体密封，使得样品可以从样品转移装置(例如注射器)经过通道114”的第一区段、经过内腔230和经过通道114”的第二区段流动到室112。如图1OE中所见，锁定阀200然后可以在空位202内滑动以使通道114”处于锁定构型，使得内腔230不与微流通道对齐。在该锁定构型中，O形环元件222a在通道114”周边形成流体密封，由此彼此隔离和封闭各个通道114”并且防止室112之间通过经通道的回流的交叉污染。
[0056]在一个实施方式中，锁定阀200的增大的末端部240可以位于与图1OE的锁定构型中的元件110”’齐平，使得一旦锁定阀200已经锁定了通道，用户不能握持端部240并解锁通道114”。这样的不可逆锁定阀可以降低回流污染的风险或者样品意外排放到环境中的风险。在替代性实施方式中，锁定阀200的增大的末端部240可以从处于锁定构型中的元件110”’突出，使得用户可以握持末端部240以用锁定阀200可逆地锁定和解锁通道114”。
[0057]现结合图10A-10E参照图1OF和10G，描述了使用图10中显示的设备100的实施方式的方法。在图1OF中，锁定阀200使通道114”定位于图1OD中显示的解锁构型中。注射器或其他样品转移装置通过与鲁尔锁102配合来与设备100偶联。注射器或其他样品转移装置使样品S(和任选的液体L)经由入口 116压出到设备100中。样品S沿着元件110”’的底部在微流通道114”内行进，所述微流通道分支成多个微流通道114”(结合图1OB和1D参见图10F)。各个微流通道然后经由锁定阀200的内腔230通过元件110”’，由此将样品S带到元件110”’的顶部和含试剂130 (例如，冻干的试剂130)的室112中。如图1OG中所见，锁定阀200然后可以相对于元件110”在空位202内滑动以使通道114”位于图1OE的锁定构型中，其中所述通道被阻断。在通道114”处于锁定构型中时，样品S不能经过锁定阀200回流，其防止了室112通过经通道的回流的交叉污染。
[0058]元件110”’包括从室112延伸以将来自室112的空气A(但非样品S)排放到溢出物室125的前述排出通道118’(结合图1OA和1B参见图10G)。流控制介质150安置在室112与溢出物室125之间的通道118’内。流控制介质150可以例如包含允许空气通过但不允许流体通过的小孔疏水性材料。在空气通过流控制介质150后，其在排出通道118’内从元件110”’的顶部经由元件110”’行进到溢出物室125。图10中显示的设备100的实施方式示意性地包括空气溢出物室125和防回流锁定阀200。应理解该设备可选地可以仅包括防回流锁定阀或仅包括溢出物室。
[0059]正如设备100的其他所有实施方式一样，图10中显示的设备100的实施方式可以包括加热元件或者与加热元件(例如图7的加热元件200)偶联，以通过试剂130扩增感兴趣的一种或多种靶核酸序列(当存在于样品S中时)。靶序列扩增可以由操作者目视检测，例如通过目视检测视觉指示剂，如比色染料中的颜色偏移或者浊度变化，或者经由例如通过视觉指示剂(颜色偏移、荧光、浊度变化等)的检测来检测扩增的传感器(如图7B的传感器300)来自动检测。任选地，加热元件、元件110”’和/或设备100的其他一些方面可以在锁定阀200处于允许流动通过通道114”的开放构型中时，包括阻止元件110” ’与加热元件偶联的几何学或其他约束。这样的约束可以降低在通道114”锁定于关闭构型中之前的样品扩增的风险，由此降低室112的回流引起的交叉污染的风险。
[0060]迄今所描述的设备100的实施方式将样品S经由使样品S在室之间分配的微流通道递送到反应室112。在图11中显示的设备100的实施方式中，样品S在不使用微流体器件的情况下递送到反应室。图11中显示的设备100的实施方式说明性地包括单个反应室，但应理解设备100可以包括任何期望数量的反应室。
[0061 ] 参照图1IA，设备100包括反应室400和冲压元件500。冲压元件500包括凸(male)元件502，所述凸元件构造成在核酸扩增和检测之前压入配合到反应室400的凹(female)元件402中并密封反应室400。
[0062]如图1lB和IlD中所见，反应室400的凹元件402包括可以压入配合到其中的试剂插入件410。试剂插入件410包括切割元件412和试剂室414。试剂130位于试剂室414内。试剂130可以例如是溶液或液体形式。或者，试剂130可以是冻干的，如图10中那样。
[0063]试剂插入件410通过密封404(参见例如图11C)密封在反应室400的凹元件402内。密封404可以例如包括金属箔或塑料膜。反应室400的密封可以有利于试剂130在使用前的长期储存和/或可以确保冻干试剂130在使用前保持干燥。
[0064]如图11B、11E和IlF中所见，冲压元件500的凸元件502包括可以压入配合到其中的液体插入件510。液体插入件510包括切割元件512和液体室514。液体室514用密封516密封。密封516可以例如包括金属箔或塑料膜。液体L (如水和/或TE缓冲液)被密封在液体室514内。染料、MgS04、甜菜碱和/或等温缓冲剂可以另外地或可选地被密封在室514内。
[0065]设备100还包括与反应室400热耦合的加热元件200。加热元件200(其任选地可以在单次使用后与设备100的其余部分一起丢弃)被构造成加热反应室400的内容物以实现核酸扩增，例如等温核酸扩增，如LAMP。加热元件200可以包括例如电阻加热器，其包括包封在两层聚酰亚胺膜之间的蚀刻箔元件。加热元件还可以包括电源，如电池或者与标准壁装插座的连接，以及在具有温度控制器的反馈环中用于温度监测的热电偶，所述温度控制器用于根据期望调节监测的温度以实现核酸扩增。
[0066]反应室400优选是透明或半透明的以利于反应室的可视化，而检测感兴趣的靶核酸序列的扩增。核酸扩增可以通过比色染料的颜色偏移、通过浊度上升或通过荧光等等来检测。检测可以用裸眼和/或通过可以用后丢弃的任选传感器300实现。检测结果可以显示在可以用后丢弃的显示器上。
[0067]样品S可以直接置于反应室400和/或冲压元件500中，之后用冲压元件密封反应室。或者，包含样品S的样品收集器10可以安置在反应室400与冲压元件500之间，使得凸元件502与凹元件402的配合将样品S置于反应室400内，如图11所示。在图11的实施方式中，样品收集器10可以例如包括滤纸，如化学处理的滤纸，例如可获自Whatman (GE Healthcare的部分)的Flinders Technology Associates( “FTA”)卡。各种样品基质--包括但不限于食物、尿、唾液、黏液、排泄物、血液、精液、组织、细胞、DNA、RNA、蛋白质、植物物质、动物物质、溶液、固体和其他样品基质一一可以沉积到样品收集器10上(另外的样品基质将是明显的)。以这种方式，样品收集器10可以经由滤纸收集样品S。
[0068]为了用样品收集器10收集样品S，滤纸可以例如浸入或置入感兴趣的一种或多种基质中。另外地或可选地，一滴或多滴感兴趣的一种或多种样品基质可以例如置于或沉积到滤纸上。另外地或可选地，滤纸可以例如擦拭或抹过感兴趣的一个或多个样品基质或表面。
[0069]现参照图11G-11J，描述了使用图11中所见的设备100的实施方式的方法。如图1IG中所见，反应室400和冲压元件500接近，使得冲压元件的凸元件502与反应室的凹元件402配合来密封反应室。液体插入件510的切割元件512刺穿样品收集器10，并且凸元件502从样品收集器10移除一次冲压的样品S，由此使样品S置于反应室400内。
[0070]如图1lH中所见，反应室400与冲压元件500的持续接近导致液体插入件510的切割元件512刺穿反应室400的密封404，由此提供到试剂插入件410的通路。如图1lI中所见，更进一步的接近导致试剂插入件410的切割元件412刺穿液体插入件510的密封516，由此导致液体L流出液体室514而进说试剂室414中。如图1lJ中所见，反应室400与冲压元件500的完全接近使核酸扩增和检测所必须的全部材料(样品S、试剂130和任选的液体L)位于试剂室414 内。
[0071]在反应室与冲压元件接近后，加热元件200加热试剂室414的内容物以实现感兴趣的靶核酸序列(当存在于样品S中时)的核酸扩增。检测可以通过裸眼和/或通过传感器300实现。
[0072]图11的设备100任选地可以用作此前在2012年4月14日提交的共同未决美国专利申请序列号13/447,218中描述的仪器40的部分，该申请全文在此援引加入。具体地，图10中的设备100的反应室400和冲压元件500可以代替’218申请中显示的仪器40的冲压元件90和室70。
[0073]图1-11的方法和设备提供了在适宜于由相对不熟练的使用者在有限资源的环境中使用的(任选地用后丢弃的，例如单次使用后丢弃的)设备中完全独立的(fullycontained)、样品到结果式的核酸样品准备、(任选地多重)靶扩增和检测。
[0074]
[0075]―上文描述了本发明的优选的说明性实施方式，但对于本领域技术人员来说明显的是可以对其作各种各样的改变和改动而不背离本发明。例如，虽然设备的各种组件的配合已经描述成通过鲁尔锁连接的配合，但应理解也可以采用鲁尔滑动接头(luer slip)、压入配合或其他本身已知的配合连接件。此外，虽然设备的一些描述的实施方式说明性地采用一个或多个注射器来将样品S转移到核酸扩增和检测设备，应理解也可以采用任何替代性样品转移装置，包括为特定目的制造的转移装置。
[0076]又进一步地，虽然设备100和相关方法已经就核酸扩增和检测进行描述，但应理解该设备和相关方法可以可选地包括和/或被用于保持并分析样品而不必扩增和/或检测样品中的核酸。在这样的实施方式中，设备100可以包括使用于分析的核酸或其他样品维持在反应室内的样品支架100，所述反应室可以充当观察室和/或分析室。分析可以包括例如除核酸扩增和检测之外或者作为核酸扩增和检测的替代方式的一种或多种技术，如显微术、杂交和/或蛋白质分析。
[0077]在设备100包括样品支架时，保持样品以进行分析的方法可以包括收集样品基质、将所述样品基质经由至少一个微流通道转移到至少一个反应/观察/分析室，任选地加热所述样品基质作为分析技术的部分，和(例如在加热过程中)防止所述样品基质从所述至少一个室经由所述至少一个微流通道回流。防止回流可以在提供多个室时防止交叉污染。防止回流可以通过所述反应/观察/分析室中的单向阀和/或通过在将所述样品基质转移到所述室后阻断所述微流通道来实现。
[0078]随附权利要求旨在覆盖落入本发明的真正精神与范围内的全部这样的改变和改动。
【主权项】
1.一种用于靶核酸序列的现场扩增和检测的方法，所述方法包括: 收集样品基质； 将所述样品基质经由至少一个微流通道转移到至少一个含有核酸扩增试剂的反应室；加热所述核酸扩增试剂以在所述靶核酸序列包含在所述样品基质内时扩增所述靶核酸序列； 防止所述样品基质在加热过程中从所述至少一个反应室经由所述至少一个微流通道回流;和 在所述靶核酸序列存在于所述样品基质中时检测所述靶核酸序列的扩增。2.权利要求1所述的方法，其中防止回流进一步包括在所述样品基质转移到所述至少一个反应室时，使所述样品基质通过至少一个单向阀。3.权利要求1所述的方法，其中防止回流进一步包括在所述样品基质转移到所述至少一个反应室之后，阻断所述至少一个微流通道。4.权利要求1所述的方法，其还包括从所述至少一个反应室排出溢出物。5.权利要求1所述的方法，其还包括在一次使用后，丢弃所述样品基质、至少一个微流通道、至少一个反应室和核酸扩增试剂。6.权利要求1所述的方法，其中加热进一步包括: 用加热元件加热所述核酸扩增试剂;并 在一次使用后丢弃所述加热元件。7.权利要求1所述的方法，其中检测扩增进一步包括检测比色染料的颜色偏移、检测浊度上升或检测荧光。8.权利要求1所述的方法，其中转移进一步包括将所述样品基质经由至少一个分支的微流通道转移，所述分支的微流通道在多个反应室之间分配所述样品基质。9.权利要求8所述的方法，其中防止回流进一步包括防止所述多个反应室之间的交叉污染。10.权利要求8所述的方法，其还包括在不同的反应室中扩增和检测不同的靶核酸序列。11.一种用于靶核酸序列的现场扩增和检测的方法，所述方法包括: 收集样品基质； 将所述样品基质从样品收集器转移到至少一个含有核酸扩增试剂的反应室； 加热所述核酸扩增试剂以在所述靶核酸序列包含在所述样品基质内时扩增所述靶核酸序列； 在加热过程中从所述至少一个反应室排出溢出物;和 检测所述靶核酸序列的扩增。12.权利要求11所述的方法，其中转移进一步包括经由至少一个微流通道转移所述样品基质。13.权利要求11所述的方法，其中收集进一步包括用样品收集器收集所述样品基质，并且其中转移进一步包括将所述样品收集器的至少一个冲孔置于所述至少一个反应室中。14.权利要求11所述的方法，其中排出溢出物进一步包括排放到至少一个隔离的溢出物室。15.权利要求11所述的方法，其中排出溢出物进一步包括在防止流体排出的同时经由流控制介质排出气体。16.权利要求11所述的方法，其还包括防止所述样品基质在加热过程中从所述至少一个反应室经由所述至少一个微流通道回流。17.用于靶核酸序列的现场扩增和检测的设备，所述设备包括: 样品收集器，所述样品收集器构造成收集样品基质； 具有至少一个微流通道、至少一个含有核酸扩增试剂的反应室和至少一个阀的装置；和 加热元件， 其中所述至少一个微流通道构造成将所述样品基质从所述样品收集器输送到所述至少一个反应室， 其中所述加热元件构造成在将所述样品基质输送到所述至少一个反应室后加热所述核酸扩增试剂以在所述靶核酸序列包含在所述样品基质中时扩增所述靶核酸序列，和其中所述至少一个阀构造成防止所述样品基质在加热过程中从所述至少一个反应室经由所述至少一个微流通道回流。18.权利要求17所述的设备，其中所述装置还包括用于从所述至少一个反应室排出溢出物的至少一个隔离室。19.权利要求18所述的设备，其中所述装置还包括用于从所述至少一个反应室排出气体但不排出液体的流控制介质。20.权利要求17所述的设备，其中所述阀选自单向阀、锁定阀、可逆阀、不可逆阀及其组入口 ο21.权利要求17-19中任一项所述的设备，其中所述阀包括滑动棒阀，所述滑动棒阀能够可选择地滑动到阻止所述至少一个反应室与所述至少一个微流通道之间的流体连通的关闭位置，或者滑动到允许所述至少一个反应室与所述至少一个微流通道之间的流体连通的开放位置。22.权利要求21所述的设备，其中具有多个反应室和多个微流通道并且处于关闭位置的所述滑动棒阀阻止多个相应的反应室与微流通道之间的流体连通。23.用于流体样品的现场分析的设备，所述设备包括: 样品收集器，所述样品收集器构造成收集流体样品;和 具有至少一个微流通道、至少一个分析室和滑动棒阀的装置，其中所述至少一个微流通道构造成将所述流体样品从所述样品收集器输送到所述至少一个分析室，和其中所述滑动棒阀构造成可选择地允许或阻止所述至少一个微流通道与所述至少一个分析室之间的流体连通。24.权利要求23所述的设备，其中具有多个反应室和多个微流通道，并且所述滑动棒阀构造成可选择地允许或阻止多个相应的反应室与微流通道之间的流体连通。25.权利要求23-24中任一项所述的设备，其中所述滑动棒阀能够可选择地在允许所述流体连通的开放位置与阻止所述流体连通的关闭位置之间滑动。26.权利要求23-25中任一项所述的设备，其中所述分析室是反应室。27.权利要求23-26中任一项所述的设备，其中所述分析包括靶核酸序列的扩增和检测。28.权利要求23-27中任一项所述的设备，其还包括加热所述流体样品的加热元件。29.权利要求23-28中任一项所述的设备，其中所述分析室包含在所述流体样品被提供到所述分析室时与所述流体样品结合的试剂。30.权利要求23-29中任一项所述的设备，其还包括成像传感器以捕获所述分析室中至少一部分所述流体样品的图像。
【文档编号】C12M1/36GK105874084SQ201480070428
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2014年10月22日
【发明人】J·P·贝林格, S·卡斯塔农, K·J·米歇利施
【申请人】科波罗斯公司