一种乙型肝炎病毒hbv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的乙型肝炎病毒(HBV)的核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。
【背景技术】
[0002]乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)，肝癌患者中，75%以上由HBV所致。
[0003]我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50?100万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。
[0004]HBV已发现有9个基因型(A?I)，每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、C基因型占优势，其中北方地区(长江以北)主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、Cl亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C/D重组基因型为主；A型和BI亚型罕见。
[0005]乙型肝炎病毒的主要检测方法有:血清学检查、生化学检查及分子生物学法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。
[0006]核酸检测主要涉及核酸提取与和核酸扩增检测。
[0007]目前血清和血浆中病毒核酸的提取方法主要有煮沸裂解法、离心柱提取法及磁珠法。煮沸裂解法不能有效去除抑制成分，且易于污染；柱提取法操作过程复杂，效率低，且不易于实现自动化；磁珠法能快速实现核酸的分离与纯化，易于实现自动化操作。
[0008]国内已有多种基于实时荧光PCR技术检测HBV-DNA的试剂盒应用于实际检测中，这些试剂盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之处:1)特异性不是很好，不能检测出所有HBV的九个基因型(A-1) ; 2)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。3)检测灵敏度低，大部分约在500IU/ml左右；
实时突光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplificat1n and Testing,简称SAT)是一种直接针对核酸(DNA和RNA)快速扩增RNA并检测的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42°C )，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性结合实际样本溶液基质进行专门、针对性地设计。目前尚无针乙型肝炎病毒DNA进行实时荧光恒温扩增检测的试剂盒，进一步，能同时对乙型肝炎病毒DNA和RNA的提取、并扩增的核酸恒温扩增检测产品也未见报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒，同时进一步提供可实现HBV DNA和RNA同步扩增检测的产品。此夕卜，本试剂盒也解决了现有技术中的乙型肝炎检测试剂盒特异性及敏感性不好，不能检测出所有HBV A-1九个基因型的技术问题。
[0010]本发明是通过以下技术方案实现:
一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光恒温扩增检测试剂盒，包含有一条乙型肝炎病毒的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的引物T7和nT7，和一条用于与所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的检测探针；所述检测引物由Τ7引物和ηΤ7引物组成，Τ7引物序列如序列表中序列I所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列2所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。
[0011]所述试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列4所示。
[0012]所述试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
[0013]进一步，所述的试剂盒所包含的捕获探针为序列表中序列4与序列5的混合物，按1:1?6:1比例(v/v)混合组成。
[0014]此外，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7弓丨物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。
[0015]进一步，所述试剂盒还包含有HBV内标和内标检测探针，可以有效监控假阴性的存在；所述HBV内标为乙型肝炎病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用Τ7和ηΤ7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA ;所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。
[0016]再进一步，所述试剂盒包含病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HBV扩增检测液、SAT酶液、HBV阳性对照、HBV阴性对照、HBV内标和稀释液，其中:
病毒核酸提取液:含捕获探针和磁珠；
洗涤液1:含NaCl和SDS ；
洗涤液2:矿物油；
HBV扩增检测液:含dNTP、ΝΤΡ、Τ7引物、ηΤ7引物、HBV检测探针和内标检测探针；
SAT酶液:含M-MLV反转录酶、Τ7 RNA聚合酶；
HBV阳性对照；含乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀释液或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；
HBV阴性对照:不含有乙型肝炎病毒靶标核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血浆溶液；
HBV内标:HBV IC RNA稀释物；
稀释液:含硫酸铵(NH4) #04和HEPES。
[0017]再进一步，所述的试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下:
Cl)病毒核酸提取液:HEPES 250-800mM, LLS 4-10%,捕获探针1_50 μ M，磁珠50_500mg/L ；
(2)洗涤液1:HEPES 5-50mM, NaCl 50-500 mM, 1% SDS，EDTA 1-1OmM ；
(3)洗涤液2:矿物油；
(4)HBV 扩增检测液:Tris 10-50mM, MgC12 10_40mM，dNTP 0.1-1OmM, NTP l_20mM，PVP40 1-10%, KCl 5-40mM，HBV引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；进一步，T7引物优选浓度为2.5pmol/反应，nT7引物优选浓度为2.5pmol/反应，HBV检测探针优选浓度为5pmol/反应，内标检测探针优选浓度为5pmol/反应；
(5)SAT酶液:M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7 RNA聚合酶200-2000U/反应、2-1OmM HEPES ρΗ7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine>0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose,40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA,0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ；
(6)HBV阳性对照；含15-1O8拷贝/mL的乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀释物或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；
(7)HBV阴性对照:不含有乙型肝炎病毒靶标核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血浆溶液；
(8)HBV内标:含14-1O8拷贝/mL HBV IC RNA的稀释物；
(9)稀释液:25-250mMHEPES，5_50mM (NH4)2S04。
[0018]所述乙型肝炎病毒HBV核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一:
(1)用于扩增HBV靶标核酸的HBV检测引物T7和nT7，Τ7引物序列如序列表中序列I所示，ηΤ7引物序列如序列表中序列2所示；
(2)用于与在Τ7RNA聚合酶作用下HBV靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HBV检测探针，所述HBV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；
(3)用于与HBV核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HBV内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示,5’端标记HEX突光基团，3 ’端标记DABCYL淬灭基团。
[0019]本发明提供了一种乙型肝炎病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有HBV检测相比，具有以下优点:
(I)本发明试剂盒针对HBV A-1 9个基因型进行靶标筛选、引物设计，涵盖范围广，具有高准确度、高特异性，可以实现对血清、血浆等样本中的乙型肝炎病毒进行快速、准确测定。
[0020](2 )本发明试剂盒针对血清、血浆基质特点，对不同周期产生的HBV DNA和RNA进行了提取优化，设计了针对性的捕获探针及提取体系，一方面避免了现有技术中提取DNA的加热、离心等操作，简化实验步骤，易于实现自动化，对检测灵敏度有了较大提高；另一方面，实现了同步提取HBV的DNA和RNA的操作。
[0021](3)本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果。
[0022](4)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有升温、降温过程，大大缩短了扩增及检测时间；同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。
[0023](5)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小。
[0024]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0025]图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；
图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果