专利名称：单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法及pna探针的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于鉴定单核细胞增多性李斯特菌(Zisteria的PNA 探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定单核细胞增多性李斯特菌的方法。
背景技术：
李斯特菌属包括单核细胞增多性李斯特菌ilisteria monocytogenes )、伊氏李斯 #lif(.Listeria、无害李其jf特菌(厶 i/wc^wa),格氏李其Jf特菌(厶 graja·)、塞氏李斯特菌、L. seeligeri )、威氏李斯特菌(Z. welsshimeri )、以及2009年新近发现的L. marthii和Z. rocourtiae.其中单增李斯特菌和伊氏李斯特菌对动物具有致病性，且单增李斯特菌为人畜共患食源性致病菌。孕妇、小孩、老年人及免疫力低下人群易感，常表现为脑膜脑炎、脑炎、骨髓炎、心肌炎、脓血症、流产等，发病率虽然不高，但死亡率较高，成年人的致死率为20% 60%，对婴儿及免疫力低下的人群致死率高达54% 90%。该菌在自然界中广泛分布，环境适应性很强，PH4. 4 9. 2、3 45°C以及高达10%NaCl的环境中均可以生长，通过多种途径进入食品加工和生产过程污染食品，对消费者健康构成潜在威胁。肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，其骨架结构单元为(2-氨乙基)甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接与主骨架的氨基N上，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，与DNA-DNA或 RNA-DNA互补链相比，PNA-DNA和PNA-RNA互补不存在静电排斥作用，因此具有很高的DNA 或RNA亲和性，在无错配的情况下其结合具有高稳定性，且杂交速度快，具有良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。同时PNA探针结合原位荧光杂交技术(FISH)，与传统生化鉴定比较，PNA-FISH法可节约大量时间，若不计增菌时间，一般耗时不超过4个小时。与PCR 等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性较低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。
发明内容
本发明的第一个目的是设计了单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，该PNA探针具单核细胞增多性李斯特菌特异性；本发明的第二个目的是提供了一种单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法结合FISH检测技术，实现对单核细胞增多性李斯特菌的快速检测。为了实现上述第一个目的，本发明采用以下技术方案
单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。为了实现上述第二个目的，本发明采用以下技术方案
单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，该方法包括以下的步骤 1)离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至OD600=O. 5-2. 0 ；
2)取10μ1菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂勻，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；
3)25μ1含500pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小时，杂交后玻片于55°C预热的洗涤缓冲液中洗涤2 次，每次10分钟；
4)取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。作为优选，上述的杂交缓冲液，ρΗ7. 5，该杂交缓冲液包括10% (w/v)硫酸葡聚糖， 10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸钠，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0. 2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-IOO 和 50 mM Tris/HCL·作为优选，上述的洗涤缓冲液，pHIO,该洗涤缓冲液包括5 mM Tris，15mM NaCl和 0. 1% (v/v) TritonX-100。本发明由于采用了上述技术方案，PNA具有与DNA和RNA特异性结合的高稳定性、 杂交快速性、及其良好的细胞穿透性，使本发明的检测方法具有快速，准确、灵敏的特性。同时结合原位荧光杂交技术使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。本发明建立了固相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
具体实施例方式下面对本发明的具体实施方式
做一个详细的说明。一、PNA探针的设计
在 NCBI 的网站上(http://www. ncbi. him. nih. gov/BLAST/)选取了 27 个分别来自 8 个种的李斯特菌的 16S rRNA的基因，用MegAlign 软件(version 5.0; DNASTAR, Madison, WI)的ClustalV算法进行排序。在排序后的在变异区域设计了单增李斯特菌特异性探针 Lm-16S-2。探针序列见表1。二、探针敏感度和灵敏度的理论验证
为了验证探针的敏感度和特异性，用BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/)和 ProbeCheck (http://131. 130. 66. 200/cgi-bin/probecheck/)对探针进行了验证。BLAST 搜索发现，所设计的探针具有较高的特异性。但也发现李斯特菌Z. marthii与Lm-16S_2 序列上存在重合，但Ζ. marthii目前只在美国纽约的一处湖泊中发现，其他地区都未有发现的报道，因此一般并不会与我们的目标细菌混淆。ProbeCheck的验证结果显示探针Lm-16S_2能检测到数据库中所有的101个目标单增李斯特菌，但和BLAST的结果一致，不能区分单增和Z. marthii.而其他检测到的非目标细菌，与李斯特菌关系都较疏远，也并非食品中常见的致病菌(表2)。随后将PNA探针与大亚基(233/ 数据库匹配检测，发现探针Lm-16S-2不与23S rRNA存在错配。经过BLAST和ftObeCheck验证，所设计的探针理论上具有很高的灵敏度和特异性。表1 PNA 探针探针序列(5’ -3’)荧光标记探针位置碱基序列；GenBank号BacUinaCTGCCTCCCGTAGGA-FAM—Lm—16S—2TAGTACAAAGGGTCG-FAM1247-1261;FJ434468
a BacUin 为阳性对照探针；引用自 Perry-0，Keefe, H. , Stender, H. , Broomer, A.， Oliveira, K. , Coull, J. , Hyldig-Nielsen, J. J. , 2001. Filter-based PNA in situ hybridization for rapid detection, identification and enumeration of specific micro-organisms. J Appl Microbiol 90(2): 180-189. 探针合成和标记由韩国Panagene完成.
表2 ProbeCheck检测PNA探针的敏感度和特异性
探针名可检测到的目标菌数/数据库中所有的目标菌数检测到的非目标菌菌数13特异性°(%)敏感度d(%)Lm-16S-2aZ. monocytogenes 101/1011099. 99100
3检测到了 ProbeCheck 16S/18S数据库中的所有101个单增李斯特菌； bProbeCheck的16S/18S数据库中共有菌株数460，783 ；非单增李斯特菌的菌株数 460，682 ；
c特异性=没有检测到的非目标菌菌株数/数据库中所有的非目标菌菌株数； d敏感度=检测到的目标菌菌株数/数据库中所有的目标菌菌株数。三、固相PNA荧光原位杂交
离心(2000g，5min)收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至0D_=0. 5-2. 0，取ΙΟμΙ菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂勻，火焰固定，将玻片于80% 的酒精中浸泡15分钟，风干；25μ1含500pmole/mlPNA的杂交缓冲液(pH7. 5，10% (w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸钠，0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烧酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA, 0. 2% (v/v) TritonX-100, 50 mM Tris/HCl)滴加于玻片上，55°C作用1_1.5小时，杂交后玻片于551预热的洗涤缓冲液(？!110，5 mM Tris, 15mM NaCl,0. 1% (v/v) TritonX-100)中洗涤2次，每次10分钟，取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。试验例1 PNA-FISH敏感度验证
对9株不同血清型的单增李斯特菌进行敏感度验证。试验方法如上所述。每次试验(包括以下实例2和3)都同步进行阳性对照和阴性对照试验，阳性对照试验，用探针BacUin替代其他探针，而阴性对照试验中，用空白替代其他探针。结果显示，所有的菌株都能和阳性对照探针BacUin和探针Lm-16S_2结合(见表 3)。上述结果和预设结果一致，探针Lm-16S-2能检测到自己的目标菌株，有较高的敏感度。表3 PNA探针敏感度试验
权利要求
1.单核细胞增多性李斯特菌(listeria的肽核酸原位荧光鉴定用 PNA探针，其特征在于该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
2.单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于该方法包括以下的步骤1)离心收集对数生长期的细菌，用PBS洗涤一次，再用PBS调整菌液浓度至 OD600=O. 5-2. 0 ；2)取10μ1菌液于98%酒精清洗过的玻片上涂勻，火焰固定，将玻片于80%的酒精中浸泡15分钟，风干；3)25μ1含500pmole/mlPNA探针的杂交缓冲液，PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO 1 所示，滴加于玻片上，55°C作用1-1. 5小时，杂交后玻片于55°C预热的洗涤缓冲液中洗涤2 次，每次10分钟；4)取2 5μ1菌液涂片，风干后显微镜观察其荧光亮度及细菌的形态。
3.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于杂交缓冲液，ΡΗ7. 5，该杂交缓冲液包括10%(w/v)硫酸葡聚糖，10 mM NaCl, 30% (ν/ ν)甲酰胺，0.1% (w/v)焦磷酸钠，0.2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮，0.2% (w/v)聚蔗糖，5 mM Na2EDTA,0. 2% (v/v) TritonX-100 和 50 mM Tris/HCl。
4.根据权利要求2所述的单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定方法，其特征在于洗涤缓冲液，pHIO，该洗涤缓冲液包括5 mM Tris, 15mM NaCl和0. 1% (ν/ν) TritonX-100。
全文摘要
本发明涉及用于鉴定单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes)的PNA探针的设计，及应用PNA-FISH法鉴定单核细胞增多性李斯特菌的方法。 单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸原位荧光鉴定用PNA探针，其特征在于该PNA探针的DNA序列如SEQ ID NO1所示。本发明并将探针N端标记荧光素，与荧光原位杂交技术结合用于检测。同时建立了固相荧光原位杂交检测方法，并优化了杂交条件。PNA-FISH法具有快速特点，一般整个鉴定过程耗时不超过4个小时；PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去繁琐DNA提取的步骤。
文档编号C12N15/11GK102358908SQ20111033342
公开日2012年2月22日 申请日期2011年10月28日 优先权日2011年10月28日
发明者吴姗, 帅江冰, 张晓峰, 李可, 董强 申请人:浙江省检验检疫科学技术研究院