专利名称：漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器的信号放大方法，特别涉及漏声表面波-双体肽核酸
生物传感器的信号;^文大方法。
背景技术：
随着分子生物学技术的发展，基因快速检测已成为临床病原学早期诊断的 重要手段之一。核酸传感器由于具有高效、灵敏、特异、结构小巧、经济实用 等特点，将在基因快速检测中发挥重要作用。
核酸传感器是将能够特异识别靶DNA的核酸纟果针固定于固相支持物表面， 与核酸标本进行杂交反应，并将杂交反应结果利用各种类型的换能器转换为声、 光、电等可检测的物理信号，从而实现对核酸标本中耙DNA的检测。
传统的单链DNA探针由于无法直接与靶DNA杂交，需要与PCR技术相结合 才能检测临床标本。肽核酸(p印tide nucleic acid， PNA)是具有类多肽骨架的 DNA类似物，可以高亲和性、高特异性地与DNA或RNA杂交，且形成的杂交复 合物具有高热稳定性和独特的耐离子强度变化性质，其中双体肽核酸(bis-PNA) 更是以"链侵袭，，的方式与DNA形成稳定性更高的四链体结构，可以直接检测耙 DNA。
自从Sauerbrey提出用体波模式的压电石英晶体传感器检测质量吸附以来， 体波模式生物传感器的研究与应用日趋成熟，但体波传感器的震荡频率是靠晶 体的厚度振动，在客观上限制了体波传感器最低^r测限的进一步提高。其后， 众多研究者不断优化、改进杂交条件使压电核酸传感器的检测性能大大提高， 但压电传感器的灵敏度大小主要由压电晶体的基频高低决定，基频越高，传感 器的灵敏度越高，而随着基频增高，制作工艺对传感器信号的影响也显著增加，从而在一定程度上影响了压电传感器的检测精确度。相对于其他类型的传感器
而言，近年新发>^来的漏声表面波(leaky surface acoustic wave, LSAW)生 物传感器具有灵敏度高，精密度、重复性和可靠性好等优点。
因此，在前期研究工作中，本发明人采用LSAW传感器和bis-PNA构建了 漏声表面波-双体肽核酸(LSAW-bisPNA)生物传感器，并创新性地将LSAW传 感器的检测系统制备成双端对谐振型，在检测过程中参比通道可有效减低非特 异性因素的影响，进一步提高了传感器的检测性能。但同时发现，采用LSAW-bisPNA 生物传感器进行临床病原微生物的基因检测时，由于基因组DNA质量 微小，其杂交反应引起的相位变化值较小，且反应时间较长，对检测灵敏度造 成严重的制约。因此，如何将信噪比放大，提高检测灵敏度成为改进传感器检 测方法的目标之一。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种LSAW-bisPNA生物传感器的信号放 大方法，可以有效提高传感器的检测灵敏度。
为达到此目的，本发明提供了一种LSAW-bisPNA生物传感器的信号放大方 法，是在bis-PNA探针与核酸标本的杂交反应体系中加入"RecA蛋白-互补单链 DNA，，探针共同反应；
所述"RecA蛋白-互补单链DNA"探针可由以下方法得到首先根据耙DNA
探针序列；然后将RecA蛋白与2种单链DNA在ATPyS存在下共孵育，使RecA 蛋白与2种单链DNA结合，即得"RecA蛋白画互补单链DNA"探针。
进一步，所述"RecA蛋白-互补单链DNA"探针可由以下方法得到将含 有2种单链DNA的溶液于80。C水浴3分钟，4。C冷却2分钟，加入緩沖液和 ATPyS,室温静置5分钟，再加入RecA蛋白，37。C水浴15分钟，即得"RecA 蛋白-互补单链DNA"探针；
进一步，所述LSAW-bisPNA生物传感器是在LSAW传感器检测通道金膜表面固定能特异识别人乳头瘤病毒基因组DNA的bis-PNA探针；所述bis-PNA 探针序列如下5'-SH-(CH2)6-(Lys)rttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys;
进一步，所述2种互补的单链DNA序列如下Pl: 5'-cgatgaaatagatggagtta-3，； P2: 5 '-taactccatctatttcatcg画3';
进一步，所述bis-PNA探针的固定方法为在LSAW传感器检测通道中加 入Na—浓度为20mmol/L、 pH为6.6的PBS 20joL，稳定30分钟，再加入终浓度 为2pmol/L的bis-PNA探针5pL,室温下反应1小时使探针固定在金膜表面， 吸干溶液，去离子水清洗3次，氮气吹干，即得；
进一步，所述"RecA蛋白-互补单链DNA，，探针可由以下方法得到取浓 度均为10nmol/L的单链DNAPl和P2各10pL，加入去离子水60pL, 8(TC水浴 3分钟，4'C冷却2分钟；取上述溶液14)jL，加入緩沖液7.0pL和浓度为2.5mmol/L 的ATPyS 3.5[iL，室温静置5分钟，再加入浓度为45pg/mL的RecA蛋白0.5jjL, 37。C水浴15分钟，即得"RecA蛋白-互补单链DNA"探针；
进一步，所述信号^L大方法是将LSAW-bisPNA生物传感器在空气中稳定至 平衡，检测通道和参比通道各加入Na+浓度为20mmol/L、pH为6.6的PBS 20^L, 稳定10分钟，再各加入终浓度为100^ig/L的核酸标本20jjL和"RecA蛋白誦互 补单链DNA探针，，25^L进行杂交反应。
RecA蛋白是含4个亚基的四聚体，能够与双链DNA或单链DNA结合，在 原核生物DNA损伤的修复和同源重组中起重要作用。RecA蛋白有2个DNA结 合位点，在离体条件下，不借助其他任何蛋白的帮助，RecA蛋白能迅速启动同 源DNA分子的联会，使双链DNA分子的1条链与来自另一双链DNA分子的1 条链交换，从而产生异源双链DNA分子。ATPyS是ATP类似物，RecA蛋白与 双链DNA或单链DNA的结合需要ATPyS水解供应能量。
本发明利用"RecA蛋白-互补单链DNA，，探针可与bis-PNA/双链DNA复 合物结合形成多链体的生物学特性，提高LSAW-bisPNA生物传感器表面的质量 负载，从而有效提高传感器的检测灵敏度，且方法操作简便，杂交反应时间缩短，成本低廉，适用于微量临床病原微生物的基因快速检测。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发
明作进一步的详细描述，其中
图1为LSAW-bisPNA生物传感器直接检测HPV基因组DNA的相位变化； 图2为LSAW-bisPNA生物传感器加"RecA蛋白-互补单链DNA"探针检
测HPV基因组DNA的相位变化；
图3为阴性对照实验LSAW-bisPNA生物传感器的相位变化。
具体实施例方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实 施例进行详细的描述。 1、实验材料
(1)双端对谐振型LSAW传感器的制作在同一块钽酸锂(LiTa03)晶体 上制备检测和参比两个通道，每个通道由一个LSAW谐振器构成。LiTa03晶体 为Y方向切割36°旋转、X方向传播LSAW,通过记录相位变化来检测肽欢体核 酸探针与靶核酸序列的杂交反应。金膜和LiTa03晶体之间是金属铬。叉指换能 器是用真空镀膜的方法先在基片表面镀制一层金属膜，再利用光刻技术刻出叉 指电极的图形。
(2 )数据采集系统及相位记录分析软件使用多功能网络分析仪(日本 ADVANTEST公司R3767CG型)采集实验数据；自行研发的相位记录分析软件 BSMS 1.0具有实时记录变化，自动绘制相位变化趋势图及分析结果等功能。
(3 )主要试剂PBS: Na+浓度为20mmol/L, pH为6.6，含有浓度为lmmol/L 的乙二胺四乙酸；piranha液将质量百分浓度为30%的过氧化氢和浓H2S04 按体积比为i : 3混合均匀即得；pBR322-HPV18质粒购自ATCC〃^司；质粒抽
7提试剂盒购自博大泰克公司；胶回收试剂盒购自Omega公司；限制性核酸内切 酶￡coR I购自TaKaRa 7〉司；RecA蛋白(包括緩冲液)购自New England Biolabs 公司；ATPyS购自Sigma ^>司；bis-PNA探针序列5'-SH-(CH2)6-(Lys)3-ttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys-3，， SH为巯基、Lys为赖氨酸、egl为linker分子，由成都川 抗派德生物医药科技有限公司合成；2种互补的单链DNA序列PI: 5'-cgatgaaa tagatggagtta誦3， ( SEQ ID No.l ) ， P2: 5'-taactccatctatttcatcg-3 ， ( SEQ ID No.2 )， P2序列紧邻于bis-PNA探4十序列，PI与P2互补，由上海生工生物工程技术服 务有限公司合成。 2、实-验方法
(1) HPV基因组DNA的抽提pBR322-HPV18质粒含有HPV全基因组， 用质粒抽提试剂盒抽提pBR322-HPV18质粒，所得质粒用五coR I酶切，酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒切胶回收纯化目的片段，得HPV基因 组DNA,具体操作按试剂盒说明书进行。
(2) "RecA蛋白-互补单链DNA"探针的制备取浓度均为10拜ol/L的单 链DNAPl和P2各10pL，加入去离子水60nL, 80。C水浴3分钟，4。C冷却2分 钟；取上述溶液14mL,加入緩沖液7.0)iL和浓度为2.5mmol/l的ATP/S3.5mL, 室温静置5分钟，再加入浓度为45|ig/mL的RecA蛋白0.5jjL, 37。C水浴15分 钟，得"RecA蛋白-互补单链DNA，，探针。
(3) LSAW传感器的LiTa03晶振金膜表面预处理在LSAW传感器的 LiTa03晶振金膜表面滴加少许piranha液，浸泡10分钟，超纯水反复清洗，再 依次用浓度为lmol/L的NaOH和浓度为lmol/L的HC1各浸泡10分钟，超纯水 反复清洗，氮气吹干，备用；
(4) LSAW传感器的稳定性检测将预处理后的LSAW传感器以同轴电缆 线联入多功能网络分析仪，室温下检测两个谐振器的插入损耗，将两个谐振器 的插入损耗调整至最小；
(5 ) bis-PNA探针的固定将LSAW传感器在空气中稳定30分钟后，检测通道和参比通道各加入PBS 20joL，稳定30分钟，检测通道再加入终浓度为 2Mmol/L的bis-PNA探针5pL,室温下反应1小时使探针固定在金膜表面，吸干 溶液，去离子水清洗3次，氮气吹干，备用。参比通道不固定任何探针。
(6) HPV基因组DNA的检测将LSAW-bisPNA生物传感器在空气中稳 定至平衡，检测通道和参比通道各加入PBS 20pL，稳定IO分钟，再各加入终 浓度为100pg/L的HPV基因组DNA 20^L进行杂交反应，或者再各加入终浓度 为100pg/L的HPV基因组DNA 20jjL和"RecA蛋白-互补单链DNA"探针25|iL 进行杂U应；同时进行阴性对照实验(检测通道和参比通道各加入PBS进行 杂交反应)；观察杂交平衡时间及引起的相位变化值，实验重复3次取平均值。 3、实验结果
结果见图1~3,用LSAW-bisPNA生物传感器检测HPV基因组DNA，不加 入"RecA蛋白-互补单链DNA"探针时，杂交反应58分钟达到平衡，反应前后相 位变化值约3.2度(图1);加入"RecA蛋白-互补单链DNA"探针后，杂交反 应50分钟达到平衡，反应前后相位变化值约10.1度(图2);在阴性对照实验 中，杂M应前后的相位值基本没有变化(图3 )。
在"RecA蛋白-互补单链DNA"探针的制备中，本发明人对RecA蛋白和ATPyS 的最佳浓度进行了考察。
1、 RecA蛋白最佳浓度的选择
方法按照前述"RecA蛋白-互补单链DNA"探针的制备方法，分别采用 浓度为15、 30、 45、 60、 75pg/mL的RecA蛋白制备"RecA蛋白-互补单链DNA" 探针；将LSAW-bisPNA生物传感器在空气中稳定至平衡，检测通道和参比通道 各力口入PBS 20joL,稳、定10分钟，再各加入终浓度为100pg/L的HPV基因组DNA 20^L和由不同浓度的RecA蛋白制成的"RecA蛋白-互补单链DNA"探针25jiL 进行杂交反应；同时进行阴性对照实验(检测通道和参比通道各加入PBS进行 杂交反应)；观察反应平衡时间及引起的相位变化值，实验重复3次取平均值。结果见表l，随着RecA蛋白浓度从15^ig/mL增加到75^ig/mL，传感器的相 位变化值出现了先升高后下降的趋势，当RecA蛋白浓度为45pg/mL时引起的反 应效果最为显著(PO.01 ),且相位变化值与杂交平衡时间的比值也远远高于其 他浓度组；而杂交平衡时间总体上未有明显的变化趋势(P>0.05)。因此，综合 分析，选择45pg/mL为RecA蛋白的最佳浓度。
表l 不同RecA蛋白浓度对传感器杂交效应的影响(x±s)
RecA蛋白浓度Qig/ml)相位变化(deg)杂交平衡时间(min)比值(deg/min)
阴性对照2.97±0.19a58.53±11.330.05
153.52±0.27a56.97±10.910.06
304.42±0.25a51.83±11.770.09
4511.74±1.0349.27±8.560.24
606.82±0.47a63息12.060.11
755.41±039a52.07±8.960.10
a:与RecA蛋白浓度为45ng/mL组比较，PO.Ol。
2、 ATPYS最佳反应浓度的选择
方法按照前述"RecA蛋白-互补单链DNA，，探针的制备方法，分别采用 浓度为0.25、 0.5、 1.5、 2.5、 3.5、 4.5mmol/L的ATPyS制备"RecA蛋白-互补单 链DNA"探针；将LSAW-bisPNA生物传感器在空气中稳定至平衡，检测通道 和参比通道各加入PBS 20pL,稳定10分钟，再各加入终浓度为100路/L的HPV 基因组DNA20mL和由不同浓度的ATPyS制成的"RecA蛋白-互补单链DNA"探 针25^L进行杂交反应；同时进行阴性对照实验(检测通道和参比通道各加入 PBS进行杂交反应)；观察反应平衡时间及引起的相位变化值，实,验重复3次取 平均值。
结果见表2，在RecA蛋白的最佳浓度下，随着ATPYS浓度从0.25mmol/L增 加到2.5mmol/L,杂交反应引起的相位变化值逐渐增高(尸<0.01 )，但随着ATPyS 浓度继续增加到4.5mmol/L，杂交反应引起的相位变化值依次降低(户<0.01),而
10杂交平衡时间总体上未有明显的变化趋势(P>0.05)。因此，综合分析，选择 2.5mmol/L为ATPyS的最佳浓度。
表2 不同ATP"yS浓度对传感器杂交效应的影响(；±s)
ATPys浓度(謹ol/L)相位变化(deg)杂交平衡时间(min)
0.253.23±0.24a43.87±7.20
0.54.10±0.20a52.04±6.56
1.55.31±0.69a54.76±5.57
2.510.71±0.7350.33±8.05
3.56.78±0.51a48.10±7.49
4.55.84±0.33a66.75±5.54
a:与ATP丫s浓度为2.5mmol/L组比较，PO.Ol。
基于上述实验结果，可得出如下结论与bis-PNA探针和靶DNA直接进行 杂交反应相比，加入"RecA蛋白-互补单链DNA"探针共同反应，LSAW-bisPNA 生物传感器的检测灵敏度显著提高，杂交反应时间明显缩短。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术 人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所 附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。序列 表
<110>中国人民解;^文军第三军医大学第一附属医院
<12 0>漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号》文大方法
<160〉 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>单链DNA Pl序列
<400> 1
cgatgaaata gatggagtta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DM
<213> 人工序列
<220>
<223〉 单链DMP2序列
<400> 2
taactccatc tatttcatcg 20
权利要求
1、漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方法，其特征在于在双体肽核酸探针与核酸标本的杂交反应体系中加入“RecA蛋白-互补单链DNA”探针共同反应；所述“RecA蛋白-互补单链DNA”探针可由以下方法得到首先根据靶DNA序列设计并合成2种互补的单链DNA，使其中1种单链DNA序列紧邻于双体肽核酸探针序列；然后将RecA蛋白与2种单链DNA在ATPγS存在下共孵育，使RecA蛋白与2种单链DNA结合，即得“RecA蛋白-互补单链DNA”探针。
2、 根据权利要求1所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述"RecA蛋白國互补单链DNA"探针可由以下方法得到 将含有2种单链DNA的溶液于80。C水浴3分钟，4。C冷却2分钟，加入緩冲液 和ATFyS,室温静置5分钟，再加入RecA蛋白，37。C水浴15分钟，即得"RecA 蛋白-互补单链DNA"探针。
3、 根据权利要求2所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述漏声表面波-双体肽核酸生物传感器是在漏声表面波传感 器检测通道金膜表面固定能特异识别人乳头瘤病毒基因组DNA的双体肽核酸探 针；所述双体肽核酸4笨针序列如下5'-SH-(CH2)6-(Lys)rttttcttcct-(egl)3-tccttctttt-Lys。
4、 根据权利要求3所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述2种互补的单链DNA序列如下Pl: 5'-cgatgaaatagatggag tta國3，； P2: 5'-taactccatctatttcatcg画3，。
5、 根据权利要求4所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述双体肽核酸探针的固定方法为在漏声表面波传感器检 测通道中加入Na+浓度为20mmol/L、 pH为6.6的PBS 20^L,稳定30分钟，再 加入终浓度为2pmol/L的双体肽核酸探针5pL,室温下反应1小时使探针固定在金膜表面，吸干溶液，去离子水清洗3次，氮气吹干，即得。
6、 根据权利要求5所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述"RecA蛋白-互补单链DNA，，探针可由以下方法得到 取浓度均为10pmol/L的单链DNA Pl和P2各10pL,加入去离子水60pL, 80 。C水浴3分钟，4。C冷却2分钟；取上述溶液14pL，加入緩冲液7.0mL和疼度为 2.5mmol/L的ATPyS 3.5^iL，室温静置5分钟，再加入浓度为45pg/mL的RecA 蛋白0.5jiL， 37。C水浴15分钟，即得"RecA蛋白-互补单链DNA"探针。
7、 根据权利要求6所述的漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方 法，其特征在于所述信号放大方法是将漏声表面波-双体肽核酸生物传感器在 空气中稳定至平衡，检测通道和参比通道各力口入Na+浓度为20mmol/L、 pH为 6.6的pbs 20mL,稳定10分钟，再各加入终浓度为100|ig/L的核酸标本20joL 和"RecA蛋白-互补单链DNA"探针25joL进行杂交反应。
全文摘要
本发明公开了漏声表面波-双体肽核酸生物传感器的信号放大方法，是在双体肽核酸探针与核酸标本的杂交反应体系中加入“RecA蛋白-互补单链DNA”探针共同反应；“RecA蛋白-互补单链DNA”探针可由以下方法得到先根据靶DNA序列设计并合成2种互补的单链DNA，使至少1种单链DNA序列紧邻于双体肽核酸探针序列；再将RecA蛋白与2种单链DNA在ATPγS存在下共孵育，使RecA蛋白与2种单链DNA结合，即得；本发明利用“RecA蛋白-互补单链DNA”探针可与bis-PNA/双链DNA复合物结合形成多链体的生物学特性，提高传感器表面的质量负载，从而有效提高传感器的检测灵敏度，且方法操作简便，杂交反应时间缩短，成本低廉，适用于微量临床病原微生物的基因快速检测。
文档编号C12Q1/68GK101586166SQ20091010409
公开日2009年11月25日 申请日期2009年6月15日 优先权日2009年6月15日
发明者府伟灵, 张立群, 王云霞, 鸣 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院