分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于土壤科学领域，涉及植物营养学及植物生理学研究方法，尤其涉及一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法。
【背景技术】
[0002]自从1840年李比希(Liebig)创立了“植物矿质营养学说”起，大多数的研究都针对无机氮展开，而有机营养的研究而相对落后。近十年的研究表明，大多数植物具备吸收氨基酸、多肽、核酸，甚至大分子蛋白质的能力。尽管植物可以吸收有机氮已经成为共识，但自然环境下土壤氨基酸周转迅速，因此自然环境下氨基酸的营养贡献仍没有定论。Lipson等根据植物-微生物竞争吸收的模型，计算出氨基酸对高山植物的营养贡献率不低于50 %。然而，在亚热带地区，根据13C，15N双标记技术研究得出其营养贡献率低于1%。从不同地区氨基酸营养贡献的差异可以看出，环境条件对氨基酸营养贡献具有重要的作用。
[0003]环境因子包括温度、光照强度、二氧化碳浓度、土壤氮素组成及含量、土壤酸度、土壤结构、土壤污染物组成及浓度等，这些因子会对氨基酸营养贡献产生较大的影响。这些因素不止影响土壤中氨基酸的生物有效性，还会对植物根系吸收、根系到地上部的转运、根系及地上部氨基酸的代谢等产生较大的影响。然而，关于该方面的研究及研究方法相对缺乏，缺少系统准确的测定影响作用的方法，尤其是从植物营养和植物生理角度综合分析环境因素对氨基酸营养代谢的影响。
【发明内容】
[0004]本发明旨在解决研究环境因素对氨基酸吸收代谢影响方法缺乏的问题，提供一种分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法，是一种采用同位素示踪技术及气相色谱_同位素质谱联用技术，分析环境因素影响氨基酸营养贡献机理的方法。
[0005]本发明方法通过以下步骤实现:
[0006]1.环境因子对氨基酸长期吸收的影响
[0007]采用无菌营养液培养方法:以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，更换为3mM 5-55 % 15N-甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、C02浓度等，每2-3d更换一次营养液，培养6-25d后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗I分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根据此步骤可以分析环境因素对植物生长及氨基酸吸收的长期影响；
[0008]2.环境因子对氨基酸短期吸收及吸收方式的影响
[0009]采用如步骤I所述的培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水多次冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8-10h，之后将其根系放置于50μπιΟ1 L-1CCCP溶液中I小时，使其根系失活，然后以不用CCCP处理的幼苗做对照，将植物放置于含3mM 98.1Oat.%15N_甘氨酸的营养液中，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，进行标记氨基酸的短期吸收及吸收方式试验，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，培养2-6h后破坏性采样，将植物根系与地上部分开，根系放于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗I分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和地上部一起放于球磨仪中粉碎，采用同位素质谱分析不同环境条件下处理的植物氮素含量及甘氨酸吸收量，根据步骤I的结果，可以确定环境因子对甘氨酸吸收的长期效应，即对吸收和后续代谢的影响，而根据步骤2的短期吸收结果，可以分析环境因素对根系吸收及吸收方式的影响，进而推测影响甘氨酸营养贡献的限速步骤。
[0010]3.环境因子对氨基酸在植物体内代谢的影响
[0011 ]采用步骤I所述的无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸铵+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养植物15-25d后，选择生长状态一致的植物，采用灭菌纯净水多次冲洗根系及离心管后，将植物放置于清水中8-24h，之后更换为3mM 50-99.8 % 15N-甘氨酸为氮源，，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置相应的环境条件，如光照强度、营养液pH、CO2浓度等，培养10-24h后破坏性采样，将植物根系于清水中清洗三次，接着放置于超声波清洗机中清洗I分钟，采用0.5M氯化钙溶液清洗三次，最后用纯净水冲洗三次，以去除吸附于根系上的15N,采用冷冻干燥或者烘箱烘干后，将根系和植物地上部一起放于球磨仪中粉碎;称取20mg经干燥后粉碎的植物样品，加4ml 80%乙醇放置于震荡机中以10-30r/min震荡提取lh，提取液在3500-4500g/min离心15min，保留上清液，残渣用Iml 80 %乙醇再提取Ih，10000-12000g离心5-15min，两次离心的上清液混合，采用N2吹干或者低温低压旋转蒸发仪于25-35°C下蒸干，再次用2ml 0.lmol/L HCl溶解，在10000-15000r/min转速下离心10_15min，上清液倾倒于体积为2cm3的阳离子交换柱中(Dowex 50WX8-200)，该阳离子交换柱采用20ml超纯水清洗，其中的氨基酸采用20ml4mol/LNH40H洗脱，洗脱液氮吹过夜，去除其中的NH3，之后冷冻干燥，在剩余的提取物中的氨基酸就转变为相应的叔丁基二甲基衍生物，之后提取物中氨基酸浓度及15N丰度采用气相色谱-同位素质谱联用仪进行检测(GasChromatography Mass Spectrometry)ο
[0012]采用步骤I可以研究环境因素对植物长期吸收的影响，而步骤2主要研究环境因素对植物根系吸收能力的影响，步骤3主要研究环境因素对植物体内氨基酸代谢的影响，结合三方面结果，就可以综合评价环境因素对植物吸收利用氨基酸的影响，并解释具体的代谢限速步骤。
[0013]本发明通过采用无菌培养结合同位素示踪技术，研究环境因素对植物生长及氨基酸吸收的影响，确定环境因素的长期效应，之后采用短期吸收及添加代谢抑制剂的方法，研究环境因素对根系短期吸收氨基酸及吸收方式的影响，最后采用同位素示踪结合气相色谱-同位素质谱联用检测技术，确定环境因素限制甘氨酸代谢的限速步骤。该方法操作简单，采用的同位素示踪技术及气相色谱-同位素质谱联用检测技术精密度和可信度较高，可以有效的分析环境因素影响氨基酸营养贡献的机理，解决研究环境因素对氨基酸吸收代谢影响方法缺乏的问题。
【附图说明】
[0014]图1是光照强度对甘氨酸长期吸收的影响。
[0015]图2是光照强度对甘氨酸短期吸收的影响。
[0016]图3是光照强度对小白菜地上部含15N氨基酸的影响。
[0017]图4是光照强度对小白菜根系含15N氨基酸的影响。
[0018]图5是营养液酸度对甘氨酸长期吸收的影响。
[0019]图6是营养液酸度对甘氨酸短期吸收的影响。
[0020]图7是营养液酸度对小白菜地上部含15N氨基酸的影响。
[0021 ]图8是营养液酸度对小白菜根系含15N氨基酸的影响。
【具体实施方式】
[0022]本发明结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0023]实施例1一种分析光照强度影响氨基酸营养贡献机理的方法
[0024]操作步骤如下:
[0025]步骤一:光照强度对氨基酸长期吸收的影响(以小白菜为例)
[0026]采用无菌营养液培养方法，以2mM硝酸钠+0.5mM硫酸钱+0.5mM甘氨酸为氮源，营养液中除氮外其它元素含量参照霍格兰营养液配方，在50ml离心管中培养小白菜25d后，选择生长状态一致的小白菜，更换为3mM 50.16 % 15N-甘氨酸为氮源，营养液中其它元素含量参照霍格兰营养液配方，设置光照条件为90、360、540ymol m—2s—1 (前期研究表明360ymol m—2S+1强度下最适合小白菜生长，而90和540μπιΟ1 m—S—1强度下则分别过低和过高)，每2d更