专利名称：沙门氏菌血清组a、b、c1、c2、d的多重pcr鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种食品安全检测技术领域的多重PCR鉴定方法，具体是一种沙门氏 菌血清组A、B、Cl、C2、D的多重PCR鉴定方法。
背景技术：
沙门氏菌(Salmonella)是最重要的食源性致病菌之一，可通过食品(特别是动物 性食品)传播，可引起人类肠胃炎、败血症、痢疾以及伤寒。血清分型在研究沙门氏菌流行 性病学中是其鉴定研究的核心，对于监测疾病的爆发，传播的趋势以及疾病控制有重要作 用。目前全世界已分离出的沙门氏菌有2500多种血清型，我国约有300种血清型，但是与 人类疾病有关的血清型主要集中于A E血清组，其中A D组的致病沙门氏菌占到70%。实践中，沙门氏菌的分离、鉴定与分型，主要是采用国标的方法 (GBT4789. 4-2008)，依据沙门氏菌的生化反应，以及抗原抗体反应进行分型鉴定的。虽然此 方法直观可靠，但是还存在着一些的缺陷，如费时较长，检测通常需要3 5天；对于一些 特殊的菌株(粗糙型等菌株)无法进行鉴定，实践中需要更为简单、快速、准确的鉴定方法。 PCR技术具有快速、准确的特性，应用于沙门氏菌的血清分型鉴定有着很大的潜力。目前，用 于鉴定沙门氏菌血清组A D的多重PCR方法的靶点主要是采用沙门氏菌的rfb基因簇中 的特异基因。经对现有技术的文献检索发现，Luk J.M.，Kongmuang U.，Reeves P. R.等人 在《Journal of Clinical Microbiology》(临床微生物学杂志)1993年第31卷第8期 第 2118 2213 页发表的题为〈〈Selective amplification of abequose and paratose synthasegenes (rfb)by polymerase chain reaction for identification of Salmonella majorserogroups (A, B, C2，and D)》(通过PCR选择性扩增β -脱氧岩藻糖和泊雷糖合成 酶基因(rfb)鉴定沙门氏菌主要血清组(A，B, C2和D))。虽然这一方法能够很好的区分 不同血清组的沙门氏菌，但是只能够鉴定出血清组B、C2和D(A)，对血清组Cl不能进行鉴 定；由于血清组A和D的靶基因同源性极高，无法将两者区分出来。此后有许多研究学者不 断地探索新的检测靶点，但大多靶点还是来源于rfb基因簇。由于沙门氏菌的抗原结构呈 多态性，其相应的rfb基因簇中的基因序列在各个沙门氏菌血清型之间的排列顺序以及缺 失、突变等情况也各不相同，不易设计用于PCR方法鉴定的多重引物，因此检测方法多数是 用检测芯片鉴定，使得鉴定成本过于高昂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种沙门氏菌血清组A、B、Cl、C2、D 的多重PCR鉴定方法。本发明的方法能够快速准确的鉴定A、B、C1、C2和D5种血清组的沙 门氏菌，避免了现有方法操作繁琐，费时费力，成本高昂的缺陷。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明涉及一种沙门氏菌血清组A、B、C1、C2、D的多重PCR鉴定方法，包括如下步骤步骤一，根据碱基序列如SEQ ID N0:1 5所示的5条核酸，分别设计特异扩增引 物对；步骤二，利用步骤一所得的特异扩增引物对，采用常规PCR方法检测样品，确定样 品中沙门氏菌血清组的类型；所述确定样品中沙门氏菌血清组的类型具体为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增 结果，若有350bp和466bp条带，则说明有血清组A ；若有177bp条带，则说明有血清组B ；若 有623bp条带，则说明有血清组Cl ；若有540bp条带，则说明有血清组C2 ；若有466bp条带， 则说明有血清组D。 步骤一中，所述特异扩增弓I物对具体为，碱基序列如SEQ ID NO 1所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 6所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 7所示；碱基序列如SEQ ID NO 2所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 8所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 9所示；碱基序列如SEQ ID NO 3所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 10所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 11所示；碱基序列如SEQ ID NO 4所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 12所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 13所示；碱基序列如SEQ ID NO 5所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 14所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 15所示。步骤二中，所述常规PCR方法具体为，取5对特异扩增引物对，分别稀释到5 μ M，按 1:1:1:1: 1混合得混合引物，之后加入PCR反应体系中；30 μ L PCR反应体系具体 为10 X PCR 反应缓冲液 3. 0 μ L，25mmol/L 的 Mg2+2. 0 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTP 2. 0 μ L, Taq 酶 υ，模板溶液2 μ L，混合引物取5 μ L，最后补水至30 μ L ；PCR扩增过程如下94°C预变性 5min,之后35个循环，每个循环的程序具体为94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸30s ； 循环结束后，72°C延伸lOmin，最后降温至12°C。本发明还涉及一种引物对，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO :6所示，下游引物的 碱基序列如SEQ ID NO 7所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO :8所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 9所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 10所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 11所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO :12所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 13所示；
或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 14所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 15所示。本发明还涉及一种核酸，其碱基序列如SEQ ID NO :1所示；或者其碱基序列如SEQ IDNO :2所示；或者其碱基序列如SEQ ID NO :3所示；或者其碱基序列如SEQ ID NO :4所示； 或者其碱基序列如SEQ ID NO 5所示。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果采用本发明的检测方法鉴定沙门 氏菌血清组的A、B、Cl、C2、D，检测时间短，由于不用采用传统检测方法中必须使用的抗血 清，还可以用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的 缺陷，更加具有实用性；同时，本发明的检测靶点是采用新的基因序列，具有单一特异性，检 测结果特异，结果判定简单，降低了检测成本。
图1实施例中多重PCR鉴定结果的电泳照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如 Sambrook 等分子克隆实验室手册(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中涉及的菌株均属于现 有技术，本领域的技术人员可很容易地从公开的商业渠道获得。实施例步骤一，选择靶点及设计引物(1)经生物信息学分析，找到的沙门氏菌血清组A的特异靶点为一段来自于甲型 副伤寒菌株ATCC9150基因组全序列1927369 1928354bp的DNA序列(SEQ ID NO :1)，运 用引物设计软件Primer Premier 5. 0在这段DNA序列区段中设计一对血清组A的鉴定引 物。引物序列如下SA-L :AACAGATCCTGCACCATATC ； (SEQ ID NO 6)SA-R CAGTTTCATGATGGCAGAG ； (SEQ ID NO 7)(2)经生物信息学分析，找到的沙门氏菌血清组B的特异靶点为基因STM2087 (SEQ IDNO :2)，运用引物设计软件Primer Premier 5. 0在这段基因序列区段中设计一对血清组 B的鉴定引物。引物序列如下SB-L CGATGAGGGTTTCTAATCTC ； (SEQ ID NO 8)SB-R TCTTGCTTCAGTATCCCTTG ； (SEQ ID NO 9)(3)经生物信息学分析，找到的沙门氏菌血清组Cl的特异靶点为基因 SCH_2092 (SEQID NO 3)，运用引物设计软件Primer Premier 5. 0在这段基因序列区段中设 计一对血清组Cl的鉴定引物。引物序列如下
SCl-L :CAGTCACAACCTGGAAGA ； (SEQ ID NO 10)SCl-R :ATACAAGCCGCTGAGTGA ； (SEQ ID NO 11)(4)经生物信息学分析，找到的沙门氏菌血清组C2的特异靶点为包含基因 SNSL254_A2005 (SEQ ID NO 4)的一段序列，运用引物设计软件Primer Premier 5. 0在这 段DNA序列区段中设计一对血清组C2的鉴定引物。引物序列如下SC2-L CAGTAGAGACGACGGAGTTC ； (SEQ ID NO 12)SC2-R TACATGCTTGGCTGAGACTA ； (SEQ ID NO 13)(5)经生物信息学分析，找到的沙门氏菌血清组D的特异靶点为基因STY3763 (SEQ IDNO :5)，运用引物设计软件Primer Premier 5. 0在这段基因序列中设计一对血清组D鉴 的定引物。引物序列如下SD-L GCCAATAAACTCCACAACAT ； (SEQ ID NO 14)SD-R GGATCATGCGTTAAATGTCT ； (SEQ ID NO 15)步骤二，PCR反应体系及反应参数取步骤一所得的5对特异扩增引物对，分别稀释到5 μ M，按1 1 1 1 1混 合得混合引物；30 μ L的PCR反应体系具体为10XPCR反应缓冲液3. 0 μ L，25mmol/L的 Mg2+2. OyL, 2. 5mmol/L 的 dNTP 2. 0 μ L，Taq 酶 1U，模板溶液取 2 μ L，混合引物取 5 μ L，最后 补水至30 μ L ；PCR循环参数设定如下94°C预变性5min，之后35个循环，每个循环的程序具体 为94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸30s ；循环结束后，72°C延伸lOmin，最后降温至 12°C。步骤三，PCR扩增结果检测用15株来自A、B、C、D及E等血清组的沙门氏菌标准菌株进行了验证。这15株 沙门氏菌标准菌株的DNA溶液各取2 μ L作为PCR反应模板，按照步骤二的PCR反应体系及 反应参数进行扩增。经PCR扩增后，分别点样于2%的琼脂糖凝胶中进行电泳，并在凝胶成 像仪中观察电泳结果。验证结果如图1所示，图1中，泳道1 15 沙门氏菌标准菌株ATCC 9150(A), ATCC14028(B),ATCC 15611(B)，ATCC 6017(B),CMCC 50017(Cl)，ATCC 7001(Cl), ATCC 10708(Cl)，ATCC 51741(Cl)，ATCC 12002(C2)，CMCC 50770(D)，ATCC13076(D)，CMCC 50335(D), CMCC 50098 (D), ATCC 9270(E), ATCC 4840(G)；泳道 16 阴性对照；泳道 17 阳 性对照，模板为 ATCC 9150，ATCC 14028，ATCC 10708，ATCC12002, ATCC 13076 这 5 种菌株 的DNA混合液；泳道M IOObp分子量标准。由图1的电泳结果可知，泳道1检测出350bp和 466bp条带；泳道2 4均检测出了 177bp条带；泳道5 8均检测出了 623bp条带；泳道 9检测出了 540bp条带；泳道10 13检测出了 466bp条带；泳道14、15、16均未检测出条 带；泳道17检测出了 350bp、466bp、177bp、623bp、540bp条带；通过检测结果可证实若有 350bp和466bp条带，则说明有血清组A ；若有177bp条带，则说明有血清组B ；若有623bp条 带，则说明有血清组Cl ；若有540bp条带，则说明有血清组C2 ；若有466bp条带，则说明有血 清组D。这说明利用本实施例的检测方法进行检测具有很好的特异性，有良好的检测效果。
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1权利要求
一种沙门氏菌血清组A、B、C1、C2、D的多重PCR鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，根据碱基序列SEQ ID NO1～5所示的5条核酸，分别设计特异扩增引物对；步骤二，利用步骤一所得的特异扩增引物对，采用常规PCR方法检测样品，确定样品中沙门氏菌血清组的类型；所述确定样品中沙门氏菌血清组的类型具体为用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，若有350bp和466bp条带，则说明有血清组A；若有177bp条带，则说明有血清组B；若有623bp条带，则说明有血清组C1；若有540bp条带，则说明有血清组C2；若有466bp条带，则说明有血清组D。
2.根据权利要求1所述的沙门氏菌血清组A、B、C1、C2、D的多重PCR鉴定方法，其特征 是，步骤一中，所述特异扩增引物对具体为碱基序列如SEQ ID NO 1所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 6所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 7所示；碱基序列如SEQ ID NO 2所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 8所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 9所示；碱基序列如SEQ ID NO 3所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 10所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 11所示；碱基序列如SEQ ID NO :4所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 12所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 13所示；碱基序列如SEQ ID NO 5所示的核酸的特异扩增引物对具体为上游引物的碱基序列如SEQ ID NO 14所示；下游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 15所示。
3.根据权利要求1或2所述的沙门氏菌血清组A、B、Cl、C2、D的多重PCR鉴定方法， 其特征是，步骤二中，所述常规PCR方法具体为，取5对特异扩增引物对，分别稀释到5 μ Μ, 按1 1 1 1 1混合得混合引物，之后加入PCR反应体系中；30 μ L PCR反应体系具 体为10 X PCR 反应缓冲液 3. 0 μ L，25mmol/L 的 Mg2+2. 0 μ L，2. 5mmol/L 的 dNTP2. OyL, Taq 酶iu，模板溶液2 μ L，混合引物取5 μ L，最后补水至30 μ L ；PCR扩增过程如下94°C预变性 5min，之后35个循环，每个循环的程序具体为94°C变性60s，60°C退火60s，72°C延伸30s ； 循环结束后，72°C延伸lOmin，最后降温至12°C。
4.一种引物对，其特征在于，上游引物的碱基序列如SEQ ID NO :6所示，下游引物的碱 基序列如SEQ ID NO 7所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO :8所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 9所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 10所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 11所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 12所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 13所示；或者上游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 14所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO 15所示。
5. 一种核酸，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO 1所示；或者如SEQ ID NO 2所 示；或者如SEQ ID NO 3所示；或者如SEQ ID NO 4所示；或者如SEQ IDNO 5所示。
全文摘要
一种食品安全检测技术领域的沙门氏菌血清组A、B、C1、C2、D的多重PCR鉴定方法，包括如下步骤步骤一，根据碱基序列如SEQ ID NO1～5所示的5条核酸，分别设计特异扩增引物对；步骤二，利用步骤一所得的特异扩增引物对，采用常规PCR方法检测样品，确定样品中沙门氏菌血清组的类型；所述确定样品中沙门氏菌血清组的类型具体为凝胶电泳检测，若有350bp和466bp条带，则说明有血清组A；若有177bp条带，则说明有血清组B；若有623bp条带，则说明有血清组C1；若有540bp条带，则说明有血清组C2；若有466bp条带，则说明有血清组D。本发明的方法能够快速准确的鉴定A、B、C1、C2和D5种血清组的沙门氏菌，避免了现有方法操作繁琐，费时费力，成本高昂的缺陷。
文档编号C12N15/11GK101892320SQ201010301178
公开日2010年11月24日 申请日期2010年2月4日 优先权日2010年2月4日
发明者刘斌, 史贤明, 施春雷 申请人:上海交通大学