沙门氏菌及其五种血清型的多重pcr鉴定试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒。本发明提供了检测沙门氏菌及其五种血清型的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物对6组成。本发明针对沙门氏菌和五种重要的血清型（鼠伤寒、肠炎、阿贡那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌）的特异性片段，设计用于特异扩增的六对引物，扩增片段大小分别为沙门氏菌-425bp、鼠伤寒-198bp、肠炎-302bp、阿贡那-145bp、猪霍乱-368bp、鸡白痢-249bp，样品基因组经过多重PCR、电泳检测，即可做出相应判定。本发明通过提供六对特异性引物，利用一步多重PCR，可以鉴定出沙门氏菌和五种重要的血清型，具有快速、低成本、操作简单和结果易于判定的特点。
【专利说明】沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴定试剂盒 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种沙门氏菌及其五种血清型的多重PCR鉴 定试剂盒。 【背景技术】
[0002] 沙门氏菌作为重要的病原微生物之一，可以通过食物传播给人类，造成胃肠炎、败 血症等症状，已经成为全世界范围内重要的食源性病原微生物。生化鉴定和血清学分型是 研究沙门氏菌病流行病学的常用方法，由于沙门氏菌有2600多种血清型，常规血清学分型 需要大量的诊断血清、熟练的技术人员和繁琐的操作步骤，由于粗糙型菌和单相菌的存在， 导致常规血清学分型对部分沙门氏菌无法准确分型。因此，更加简单、准确、快速的鉴定方 法在实践中具有重要的意义。目前，鼠伤寒、肠炎、阿贡那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌作为 常见的沙门氏菌，建立快速对其进行鉴定的方法在流行病学调查和临床诊断实践中至关重 要。
[0003] 多重PCR技术是在常规PCR的基础上改进而来，即在一个PCR反应体系中，通过添 加多对引物，对多个靶点序列进行扩增、检测，其反应原理、试剂组成和操作过程与常规PCR 一致，具有更加高效、经济的特点。
[0004] 通过对已有文献的检索发现，目前对沙门氏菌的PCR鉴定有两种思路：一是针对 每个血清型的特异性片段，设计引物进行鉴定；二是针对0抗原和Η抗原的编码相关基 因，设计引物进行鉴定。刘斌等人（2012)在《Food Control》杂志发表了《Development of a novel multiplex PCR assay for the identification of Salmonella enterica Typhimurium and Enteritidis》，针对鼠伤寒和肠炎沙门氏菌的特异性片段设计出引物， 对其进行鉴定，由于仅仅能够鉴定两种血清型，具有一定的局限性。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的引物 组。
[0006] 本发明提供的引物组，由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5和引物 对6组成；
[0007] 所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成；
[0008] 所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的 单链DNA分子组成；
[0009] 所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的 单链DNA分子组成；
[〇〇1〇] 所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的 单链DNA分子组成；
[0011] 所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的 单链DNA分子组成；
[0012] 所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的 单链DNA分子组成。
[0013] 上述引物组中，所述引物组中各条引物之比为等摩尔比；
[〇〇14] 所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪 霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR 试剂。
[0016] 本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；
[0017] 上述PCR缓冲液为 Premix Ex Taq? Version2. 0 (Loading dye mix)，购自 TaKaRa, D335A ;含有Taq酶、dNTP、Mg2+、Loading buffer ;其中，Taq酶在反应体系中的量为0· 5U、 各种dNTP在反应体系中的终浓度均为0. 2mM、Mg2+在反应体系中的终浓度为2mM。
[0018] 所述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 1 μ Μ ;
[0019] 所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏 菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
[0020] 上述水为无菌水。
[0021] 本发明的第三个目的是提供一种检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR 试剂盒。
[0022] 本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂；所述沙门氏菌五种血 清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙 门氏菌。
[0023] 上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否为沙门氏 囷广品中的应用；
[0024] 或上述的引物组或上述PCR试剂在制备检测和/或辅助检测待测细菌是否为沙门 氏菌五种血清型中的任一种产品中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述沙门 氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌 和鸡白痢沙门氏菌。
[0025] 上述应用中的检测和/或辅助检测为用上述的引物组或上述PCR试剂对所述待测 细菌进行多重PCR扩增。
[0026] 上述应用中，所述多重PCR扩增的退火温度为60°C。
[0027] 本发明的第四个目的是提供一种引物对。
[0028] 本发明提供的引物对，为如下6种引物对中的任一种：引物对1、引物对2、引物对 3、引物对4、引物对5和引物对6 ;
[0029] 所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单 链DNA分子组成；
[0030] 所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的 单链DNA分子组成；
[0031] 所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的 单链DNA分子组成；
[0032] 所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的 单链DNA分子组成；
[0033] 所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的 单链DNA分子组成；
[0034] 所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的 单链DNA分子组成。
[0035] 本发明涉及一种基于多重 PCR (multiplex polymerase chain reaction)技术的 食源性病原微生物快速鉴定技术。针对沙门氏菌和五种重要的血清型（鼠伤寒、肠炎、阿贡 那、猪霍乱和鸡白痢沙门氏菌）的特异性片段，设计用于特异扩增的六对引物，扩增片段大 小分别为沙门氏菌_425bp、鼠伤寒-198bp、肠炎-302bp、阿贡那-145bp、猪霍乱-368bp、鸡 白痢-249bp，样品基因组经过多重PCR、电泳检测，即可作出相应判定。本发明通过提供六 对特异性引物，利用一步多重PCR，可以鉴定出沙门氏菌和五种重要的血清型，具有快速、低 成本、操作简单和结果易于判定的特点。 【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1为多重PCR的扩增结果图
[0037] 图2为灵敏度检测结果图 【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[〇〇4〇] 实施例1、用于检测沙门氏菌及其血清型的引物的获得
[0041] 运用生物信息学分析工具BLAST，在全基因组中找出沙门氏菌特异性序列InvA基 因(序列1)和五种血清型的特异性序列：鼠伤寒沙门氏菌特异序列(序列2)、肠炎沙门氏菌 特异序列(序列3)、阿贡那沙门氏菌特异序列(序列4)、猪霍乱沙门氏菌特异序列(序列5)、 鸡白痢沙门氏菌特异序列（序列6);针对六对特异性序列，应用PrimerPl ex2. 61分子生物 学软件，参数设置：扩增子长度l〇〇bp_500bp，引物长度18-25bp，设计出六对PCR引物，引物 序列如下：
[〇〇42] 沙门氏菌特异引物序列：
[0043] InvA-F :GCTCGTAATTCGCCGCCATT ;(序列 7)
[0044] InvA-R :CATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATT ;(序列 8)
[0045] 鼠伤寒沙门氏菌特异引物序列：
[0046] Sty-F :AGCCAGCCGATAACCTCAACTT ;(序列 9)
[0047] Sty-R :CGAAGCCATCTACCGTGAACTG ;(序列 10)
[0048] 肠炎沙门氏菌特异引物序列：
[0049] Sen-F :CGCAAGGCTATTGTTGAAGTGAAG ;(序列 11)
[0050] Sen-R :CAGTACAGGCACAGCACATCAA ;(序列 12)
[0051] 阿贡那沙门氏菌特异引物序列：
[0052] Sao-F: AATTGTCTGCGTCATTGAGTTGGA ;(序列 13 )
[0053] Sa〇-R:CGGCGGTTCTTCATCTATCTTCG ;(序列 Η)
[0054] 猪霍乱沙门氏菌特异引物序列：
[0055] Sch-F :CATTACAAGGACGAAGACGCTTATC ;(序列 15)
[0056] Sch-R :CAACAGGTATTGCCAGACACAGT ;(序列 16)
[0057] 鸡白痢沙门氏菌特异引物序列：
[0058] Sga-F :GACATCAGTACAGTTCTCCACCTC ;(序列 17)
[0059] Sga-R :CACTCCGCTTATTCACCGACAG ;(序列 18)
[0060] 实施例2、用于检测沙门氏菌及其血清型的引物的应用
[0061] 一、引物在检测沙门氏菌及其血清型中的应用
[0062] 1、基因组DNA的提取
[0063] 用12株沙门氏菌和10株非沙门氏菌进行检测，菌株组成如表1所示；使用基因组 提取试剂盒（Tiangen公司，货号DP302)，提取表1中12株沙门氏菌和10株非沙门氏菌的 基因组DNA。其中12株沙门氏菌中包括五种血清型沙门氏菌：鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门 氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
[0064] 其中Klebsiella克雷伯氏菌Sl、Serratia沙雷氏菌S2、Citrobacter枸橡酸杆菌 S3、Enterobacter cloacae阴沟肠杆菌S4均记载如下文献中：何涛.动物园灵长类动物肠 杆菌科细菌耐药性调查研究.北京：中国农业大学动物医学院，2011夏；
[0065] Enterococcus faecalis 奠肠球菌 JH2-2 记载在如下文献中：Liu Y, Wang Y, Wu C,Shen Z,Schwarz S, Du XD, Dai L,Zhang ff, Zhang Q, Shen J.First report of the multidrug resistance gene cfr in Enterococcus faecalis of animal origin. Antimicrob Agents Chemother. 2012Mar;56(3):1650-4 ；
[0066] Proteus vulgaris普通变形杆菌S5记载在如下文献中：Wang Y, Wang Y, Wu CM, Schwarz S, Shen Z,Zhang ff, Zhang Q, Shen JZ. Detection of the staphylococcal multiresistance gene cfr in Proteus vulgaris of food animal origin. J Antimicrob Chemother. 2011Nov;66(11):2521-6 ；
[0067] Salmonella Saintpaul圣保罗沙门氏菌S6记载在如下文献中：Li, R. , Lai, J. , W ang, Y. , Liu, S. , Li, Y. , Liu, K. , Shen, J. , ffu, C. 2013. Prevalence and characterization of Salmonella species isolated from pigs, ducks and chickens in Sichuan Province, China. International Journal Of Food Microbiologyl63, 14-18。
[0068] 上述各菌均可从中国农业大学获得。
[〇〇69] 表1为待检测菌株及其来源
[0070]
【权利要求】
1. 检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的引物组，由引物对1、引物对2、引物对 3、引物对4、引物对5和引物对6组成； 所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链 DNA分子组成。
2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于： 所述引物组中各条引物之比为等摩尔比； 所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱 沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
3. 检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂，由权利要求1或2所述的引 物组、PCR缓冲液和水组成； 所述引物组中的各条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为0. 1 μ Μ ; 所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪 霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
4. 检测或辅助检测沙门氏菌或其五种血清型的PCR试剂盒，包括权利要求1或2所述 的引物组或权利要求3所述PCR试剂；所述沙门氏菌五种血清型具体为鼠伤寒沙门氏菌、肠 炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
5. 权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检 测待测细菌是否为沙门氏菌产品中的应用； 或权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所述PCR试剂在制备检测和/或辅助检 测待测细菌是否为沙门氏菌五种血清型中的任一种产品中的应用。
6. 根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述沙门氏菌五种血清型为鼠伤寒沙门氏 菌、肠炎沙门氏菌、阿贡那沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌； 所述应用中的检测和/或辅助检测为用权利要求1或2所述的引物组或权利要求3所 述PCR试剂对所述待测细菌进行多重PCR扩增。
7. 根据权利要求5或6所述应用，其特征在于： 所述多重PCR扩增的退火温度为60°C。
8. -种引物对,为如下6种引物对中的任一种：引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、 弓丨物对5和引物对6 ; 所述引物对1由序列表中序列7所示的单链DNA分子和序列表中序列8所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对2由序列表中序列9所示的单链DNA分子和序列表中序列10所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对3由序列表中序列11所示的单链DNA分子和序列表中序列12所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对4由序列表中序列13所示的单链DNA分子和序列表中序列14所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对5由序列表中序列15所示的单链DNA分子和序列表中序列16所示的单链 DNA分子组成； 所述引物对6由序列表中序列17所示的单链DNA分子和序列表中序列18所示的单链 DNA分子组成。
【文档编号】C12R1/42GK104087654SQ201310110380
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2013年4月1日 优先权日:2013年4月1日
【发明者】吴聪明, 汪洋, 李瑞超, 沈建忠 申请人:中国农业大学