制备特异性沙门氏菌h:6诊断血清的工程菌株及构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及其构建方法，它是利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。利用上述技术体系能够构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗体库。该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。
【专利说明】制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株及构建方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制品【技术领域】，涉及能够制备特异性沙门氏菌系列诊断血清的工程菌株，更具体说是一种能够制备特异性沙门氏菌H: 6诊断血清的工程菌株及构建方法。
【背景技术】
[0002]沙门氏菌{Salmonella)属于肠杆菌科(feieroAacieriaceae),是革兰氏阴性菌。沙门氏菌广泛分布于自然环境及动物的肠道中，大多数能引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，有些菌株能造成人类的食源性疾病。
[0003]鞭毛是负责细菌运动的器官,对细菌致病性也有重要影响。细菌的鞭毛蛋白具有强的免疫原性，构成了细菌的鞭毛抗原(H antigen)。鞭毛蛋白与细菌的致病机理、生物膜的形成有密切的关系，也是被内在的免疫系统通过Toll-1ike 5受体所识别的一种与致病性相关的分子。鞭毛抗原(H抗原)是沙门氏菌等革兰氏阴性菌表面的主要抗原之一，其血清学水平上的变异在种内分型上有重要意义。鞭毛相位变异(选择性表达2个不同的鞭毛蛋白基因)是细菌的一种重要机制，可以使细菌适应不只一种生存环境，尤其是可以逃避宿主免疫系统。沙门氏菌有两种表面抗原:0_抗原和鞭毛蛋白(H-抗原)。沙门氏菌的鞭毛蛋白是由或/7及基因所编码的，约1.5 kb。沙门氏菌的H抗原分为第一相和第二相。一相由编码，二相由/7及编码，这两个基因通过变位机制协同表达。目前，已经确定了沙门氏菌46种O抗原和114种H抗原，在不同的组合下，产生2523种血清型。
[0004]研制沙门氏菌诊断血清一直是生物制品领域的热门课题。传统制备诊断血清的方法包括免疫原及免疫血清的制备，吸收与检定及稳定性试验等相关步骤已经非常成熟。但传统方法耗时长，工作量大。且获得的是多克隆血清，其特异性不高，常发生一些交叉反应。本发明致力于改造传统的多克隆抗体制备体系，利用当今生物学领域最经典的现代分子生物学技术，如基因缺失、克隆构建等技术实现了快速制备特异性的沙门氏菌诊断血清。利用本发明的技术能够生产用传统方法很难生产的血清，同时还可以构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗原库。利用该抗原库能够建立包含多种沙门氏菌特异抗体的抗体库，该抗体库可补充现有抗血清种类。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是构建能够制备特异性沙门氏菌H: 6诊断血清的工程菌株；
本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种能够制备特异性沙门氏菌H: 6诊断血清的工程菌株，其特征在于:它是将含有编码鞭毛抗原6基因的重组质粒pTrC99a-/7及(6)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌中得到的能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。
[0006]更具体地说是将基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒PKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB,然后再将构建的重组质、粒pTrc99a-/7及(6)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。
[0007]本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831缺失后基因大小为IlOObp (氯霉素乙酰转移酶基因)，其序列为SEQ ID NO =10
[0008]本发明所述的能够制备特异性沙门氏菌Η:6诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍为1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列为SEQ ID NO:2。
[0009]本发明进一步公开了能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌的构建方法，其特征在于按如下的步骤进行:
(1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的构建；
(2)重组质粒pTrc99a-/7及(6)的构建；
(3)含有重组质粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的构建。[0010]本发明利用现代分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，构建表面鞭毛抗原合成基因缺失的宿主菌；将不同病原微生物的表面鞭毛抗原合成基因克隆到适合表达的载体中，并转入抗原基因缺失的宿主菌中，得到一系列具有相同遗传背景，含有不同病原微生物特异性表面鞭毛抗原基因的工程菌株。用制备的工程菌抗原免疫动物，用具有相同遗传背景但不含鞭毛抗原的宿主菌吸附除去非目的抗体，能够实现交叉反应的有效去除和抗体制备的标准化和工程化。利用本发明的技术可以获得能够制备特异性H:k，H:r, H:y, H:z, H:ζ6, Η:zlO, Η:zl3, Η:zl5, Η:z28, Η:z29, Η:v, H:w, H:6 等多种沙门氏菌诊断血清的工程菌株。
[0011]本发明更加详细的构建方法如下:
1、表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的构建
本发明选用本实验室编号为G4831 (格罗斯出浦沙门氏菌)为目的菌株，利用噬菌体λ的Red重组系统介导鞭毛基因和/7及的缺失。现针对基因说明一下主要过程，先合成一对引物，每一条引物的5'端有39 bp与基因同源，3'端与抗氯霉素基因同源(用于筛选)，以抗氯霉素模板质粒pKD3 (Genebank AY048742)的氯霉素乙酰转移酶基因为模板，通过PCR扩增获得中间为一个约1033bp的氯霉素乙酰转移酶基因，其两端为39bp同源臂的线性打靶DNA片段，通过切胶回收纯化得到该片段。将该线性打靶DNA片段电击转化到提前导入Red重组系统的G4831中诱导Red重组系统适量表达，λ核酸外切酶结合到线性打靶DNA片段两39bp同源臂末端，酶切产生游离3'单链DNA区段，从而使两同源臂和G4831染色体间以链侵入的方式发生重组。线性打靶DNA片段插入到G4831染色体上基因两同源臂之间，而G4831染色体上两同源臂间的基因序列被其置换，从而完成了 fliC基因的缺失，得到的fliC基因缺失菌株。
[0012]本发明中的Red重组系统由pSim质粒完成，需要提前导入到目的菌株中。pSim质粒载有适用于很多肠道细菌的DNA重组系统，是一种温度敏感性质粒，在42°C时表达，温度高于32°C时即丢失。
[0013]/7及基因的缺失是在基因缺失菌株基础上引入另一个抗性筛选片段完成的，和基因的缺失的原理相同。经过上述两次缺失，得到/7Y基因和fljB基因均缺失的菌株。[0014]2、重组质粒pTrc99a_/7及(6)的构建
本发明通过比对ncbi上和鞭毛抗原6相关的fljB基因序列，经过比对分析设计fljB基因通用扩增引物，在两条引物的5 '端分别加入NcoI和BamH I的酶切位点。
[0015]本发明选用pTrc99a这一低拷贝质粒作为克隆载体，以本实验室编号为G4819(伦敦沙门氏_基因组为模板，用nJB基因通用扩增引物PCR扩增fljB基因(鞭毛抗原6基因)，用Nco I和BamH I做双酶切，与同样经过双酶切的载体连接，得到含有鞭毛抗原6基因的重组质粒。
[0016]3、含有重组质粒pTrc99a_/7及(6)的克隆菌株的构建
将经过酶切和PCR鉴定正确的重组质粒电转化入基因和fljB基因均缺失的菌株中，经过抗性筛选转化子和菌落PCR鉴定，得到含有能够表达鞭毛蛋白6的重组质粒的克隆菌株。
[0017]4、验证克隆表达实验:
利用细菌动力实验和血清学实验验证重组质粒的表达情况。
[0018]细菌动力实验具体是利用细菌鞭毛的游动性原理，长鞭毛的细菌能在半固体培养基中游动，不长鞭毛的细菌则无法游动，如果重组质粒能够表达出鞭毛蛋白，同时该鞭毛蛋白可以组装到鞭毛缺失菌的表面，使其长出鞭毛，恢复动力。本发明将利用克隆菌株在半固体培养基上的游动情况验证重组质粒的表达情况。
[0019]血清学实验具体是利用鞭毛抗原与相应抗体的特异性结合反应，有鞭毛的细菌能和相应的抗体发生凝集反应，没有鞭毛的细菌则不能，如果重组质粒能够表达出鞭毛蛋白，该鞭毛蛋白能够组装到鞭毛缺失菌的表面，使其长出鞭毛，就可以用血清来检测鞭毛抗原的存在情况。本发明将利用克隆菌株与相应血清有无凝集反应这一情况来验证重组质粒的表达情况。
[0020]本发明制备的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株与现有技术相t匕，具有如下优点
1、可行性好:本发明利用实验室最基本的分子生物学技术对传统的多克隆抗体制备体系进行改造，通过做缺失，建克隆等途径得到能够有效表达鞭毛蛋白6的菌株，从而获得特异性的沙门氏菌H: 6诊断血清，方法实用，可行；
2、实用性强:通过本发明制备特异性的沙门氏菌H:6诊断血清。和传统方法相比减少了大量的吸收去除工作，更省时，且工作量降低，生产的血清特异性高，交叉少，大大降低了生产血清的成本；
3、灵活性好:利用本发明的技术能够生产用传统方法很难生产的血清，同时还可以构建一个包含若干种沙门氏菌的特异抗原库。利用该抗原库能够建立包含多种沙门氏菌特异抗体的抗体库，该抗体库可补充现有抗血清种类，同时也可为其他免疫学技术的应用提供基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是本发明所使用的嗤囷体XRed重组系统的原理不意图；
图2是本发明基因缺失菌G4831 Δ fliC PCR筛选电泳结果图；图中M:DNA Marker (DL2000) ；U ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliCmutants ；
图3是本发明fljB基因缺失菌G4831 Δ fliC Δ fljB PCR筛选电泳结果图；图中 M:DNA Marker (DL2000) ;1、ddH20 control ;2、野生型 strain G4831 ;3_5、G4831 Δ fliC Δ flJB mutants ；
图4是本发明制备的沙门氏菌缺失菌株G4831 Δ fliC Δ fljB的fliC和fljB的缺失的遗传稳定性鉴定，M:DNA Marker (DL2000) ;1 和 6、ddH20 control ；2 和 7、野生型 strainG4831 ；3-5>three generations of G4831 A fliC mutant ;8_10、three generations ofG4831 Δ fliC Δ flJB mutant ；
图5是本发明构建的表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 AfliCAflJB的生长曲
线.图6是本发明中重组质粒pTrc99a-/7及(6)构建的流程图；
图7是本发明中构建的重组质粒pTrc99a-/7及(6)的物理图谱；
图8是对重组质粒的鉴定，其中:图8A:是重组质粒pTrc99a-/7及(6)的酶切鉴定结果，图中 M:DNA Marker (DL2000 Plus) ;1_3、pTrc99a-/7j^(6)/Nco I +BamHi 图 8B:是重组质粒pTrc99a-/7及(6)的PCR鉴定结果，图中M:DNA Marker (DL2000) ；UddH2O control ；2-4> PCR product of pTrc99a-/7JB(6)；
图9为本发明野生型G4831与G4831 Δ fliC Δ fljB缺失菌动力板对比图；
图10为本发明G4831 Δ fliC Δ flJB缺失菌与所建克隆菌株G4831 Δ fliC Δ flJB(pTrc99a-/7j^(6))动力板对比图。 【具体实施方式】
[0022]下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件。本发明所用到的各种试剂均有市售。
[0023]本发明所用菌株编号和来源见下表:_
实验室编号原编号中文名称_来源
G48195010~伦敦沙门氏菌CMCC
G4831丨50752 |格?出浦沙门氏菌 |巧疋
本发明所用质粒来源见下表:
【权利要求】
1.一种能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其特征在于:它是将含有编码鞭毛抗原6基因的重组质粒pTrC99a-/7及(6)，转入表面鞭毛抗原合成基因缺失的沙门氏菌G4831 Δ fliC Δ fljB中得到的能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。
2.权利要求1所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其特征在于:它是将基因用质粒pKD3上的氯霉素乙酰转移酶基因替换，将fljB基因用质粒pKD4上的卡那霉素抗性基因替换，通过抗生素初步筛选出缺失菌株，再经过PCR鉴定及测序鉴定，得到相应的缺失菌株G4831 Δ fHC AfljB,然后再将构建的重组质粒pTrc99a_/7及(6)转入其中，筛选得到能够有效表达鞭毛抗原6的工程菌株。
3.权利要求2所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其中所述一相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 缺失后基因大小为IlOObp (氯霉素乙酰转移酶基因)，其序列为SEQ ID NO =10
4.权利要求2所述的能够制备特异性沙门氏菌H:6诊断血清的工程菌株，其中所述二相鞭毛抗原合成基因缺失菌株G4831 ΛΛ/7及，缺失后基因大小仍为1500bp (卡那霉素抗性基因)，其序列为SEQ ID NO:2。
5.一种能够制备特异性沙门氏菌H: 6诊断血清的工程菌的构建方法，其特征在于按如下步骤进行: (1)表面鞭毛抗原合成基因缺失菌株(G4831及)的构建； (2)重组质粒pTrc99a-/7及(6)的构建； (3)含有重组质粒pTrc99a-/7及(6)的克隆菌株的构建。
【文档编号】C12R1/42GK103468626SQ201310446593
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月27日 优先权日:2013年9月27日
【发明者】冯露, 蒋新蕾, 王磊 申请人:南开大学