一种口腔癌特异性检测的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测口腔癌的试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 口腔癌（OralSquarmousCellCarcinomas, 0SCC)是人体常见的肿瘤之一，尤其 是在发展中国家印度、斯里兰卡、巴西等其发病率可以达到全部肿瘤的25%。近年来口腔癌 的发病率在欧美等发达国家有明显的上升趋势，特别是发病年龄趋向年轻化。口腔鳞癌不 仅发病率高，且恶性程度较高；往往造成语音、咀嚼、吞咽、面容等功能障碍和严重的面容毁 损，并威胁到患者的生命；五年生存率只有60%左右。尽管近来口腔癌手术方法的不断改 进和放疗、化疗的广泛应用，但口腔癌的五年生存率并没有明显的提高。导致这一状况的主 要原因在于：口腔癌的发病机制不清，侵袭转移机制不明，缺乏有效的早期预防和预后判 断手段。因此研究口腔癌发生和发展的分子机制，从中找到口腔癌早期预防、预后判断和 治疗方法是口腔癌研究中急待解决的重大问题。
[0003] 现有技术已知BPIFB2基因与口腔癌的关系：BPIFB2与口腔癌具有很好的相关性， 可用于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂，具有重要的临床应用价值。其中BPIFB2在癌 旁组织中的表达水平明显低于口腔癌瘤组织和对照质粒OOcopies，而在口腔癌组织中的 BPIFB2高表达，即生物信息学筛选得到的BPIFB2基因与口腔癌具有很好的相关性，可用 于制备口腔癌辅助诊断或者预后制剂。因此检测BPIFB2的表达变得尤为重要。
[0004] 核酸适体（Aptamer,又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生 物革E1标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技 术（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialenrichment,SELEX)从人工合 成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核 酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子 识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有 很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速 的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性， 在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种特异结合BPIFB2的核酸适体及其试剂盒。
[0006] 本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。
[0007] 所述核酸适体与BPIFB2蛋白具有较好的亲和能力。
[0008] 还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
[0009] 所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种： a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相 同功能的核酸适体的衍生物； b) 将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能 的核酸适体的衍生物； c) 将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功 能的核酸适体的衍生物； d) 将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生 物； e) 将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有 相同功能的核酸适体的衍生物。
[0010] 所述核酸适体可用于制备检测BPIFB2的试剂盒。
[0011] 利用本发明的核酸适体，可以捕获中唾液中的中的BPIFB2,从而用于相关口腔癌 筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很 高的应用价值。
【具体实施方式】
[0012] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0013] 实施例1BPIFB2蛋白的获得 将NP_079503所示的BPIFB2基因通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相 应的目的多肽蛋白。
[0014] 实施例2核酸适体的筛选和制备 设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括41个核苷酸的随机核酸文库如下： 5 '-ACCTGATGCCATGCATCGCA(N41)CTAGCCAGCCTITGACATCA-3'；N41 代表 41 个随机核 苷酸。
[0015] 将单链DNA文库扩增为双链DNA，产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以 回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75ygRNA 文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugBPIFB2蛋白，37°C孵育 30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L醋酸铵，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙 醇沉淀RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转 录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为 模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行11轮。得到了 16个适配子，其序列分别为SEQ IDN0:1-16所示。具体序列如下所示： BPIFB2-1：ACCTGATGCCATGCATCGCATCACACGATCATCACACCGCTCCGCCTTCCAACTACCGCTC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-2：ACCTGATGCCATGCATCGCACACCTCCACCCTTCGCAACTACCTCTCTTCCTGTAACTATT CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-3：ACCTGATGCCATGCATCGCATCTCATAACAAATCTTCATAATCTTCTATAACACTGTCAAT CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-4：ACCTGATGCCATGCATCGCACATCTATATAGAATATATTCAATCCTCTCTCTTATATGCAT CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-5：ACCTGATGCCATGCATCGCACTATCAACGACTCTCACGCAACGCTCTTCTTACTACATATA CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-6：ACCTGATGCCATGCATCGCACCATTCATATCACGAACACCCATTTATACTATATACTACCA CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-7：ACCTGATGCCATGCATCGCACGCACTAATATCCTTCATCCCTACTAATAACTCTTTTAACC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-8：ACCTGATGCCATGCATCGCACACACTCATATTTATACACCAATATCATCTCACTCTATCTC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-9：ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAAGAATGTCTTACGACATCTCGCCTACTATCCTATAT CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-10：ACCTGATGCCATGCATCGCACACATAACAATCTATTATTCCTCTATCCGCTCTTATATTCC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-11：ACCTGATGCCATGCATCGCAAACCAGTCTACTCAACCGACCACCTCAATATCATTCTCATC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-12：ACCTGATGCCATGCATCGCACTACCTATACAATACTTACTGTCTGCTTCTACTTCTATTAT CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-13：ACCTGATGCCATGCATCGCATATACTCGCAATCACTATATAAGACCACATAAATCACTTTA CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-14：ACCTGATGCCATGCATCGCACTAACCCAATATTATTAACCGCACCACTCACATAAATCAAG CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-15：ACCTGATGCCATGCATCGCATATCAACTCTCATATATTCTTCACATCCCTACCCTTGTTAC CTAGCCAGCCTTTGACATCA BPIFB2-16：ACCTGATGCCATGCATCGCAACAACATCTATCTACTTATCAACTTCAAAACTTTCATATTA CTAGCCAGCCTTTGACATCA 实施例3蛋白结合适配子的性能测定 将适配子分别取2.0yg，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP) 37°C消化lh，纯化回收去磷 酸化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[y-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol 放射性标记的适配子分别与不同浓度（l_200nM)的BPIFB2 37°C孵育30min，各组反应液 经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样 品平行做两次测定。计算各个适配子与目的蛋白的解离常数。结果如下：
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析 分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，COCH蛋白，BPIFB2蛋白，与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都 不与这些蛋白相结合，而只与BPIFB2蛋白结合保持较高的特异性。
[0016] 将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置三周。通过 RT-PCR检测，发现三周的放置其结构稳定，没有被降解。
[0017] 实施例5所述适配子疾病的诊断 取11个口腔癌患者和4个正常人的唾液分泌物，使用生理盐水稀释，获得目标样本。
[0018] 将16个偶联有标记的适配子分别与11个患者以及4个正常人的分泌物混合 30min，通过生物素分离，定量分析其中的BPIFB2蛋白的含量，通过分析发现，11个口腔癌 患者中BPIFB2蛋白的含量显著增加，超过了规定的阈值。达到了口腔癌的诊断标准。由此 可见，其诊断效果较好。
[0019] 以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本 发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于口腔癌检测的试剂盒，其含有能特异性与BPIFB2蛋白结合的核酸适体。2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体序列为SEQIDNo:1-16任 一所示。3. -种检测口腔癌的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种用于口腔癌检测的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人BPIFB2蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获唾液中的BPIFB2蛋白，通过其含量的变化来检测口腔癌，将其制备成为相应的试剂盒，将用于口腔癌的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低的好处。
【IPC分类】G01N33/574
【公开号】CN105203763
【申请号】CN201510775735
【发明人】陈博
【申请人】陈博
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月15日