本发明属于生物医药领域，具体涉及用于特异性检测结核分枝杆菌感染的蛋白。
背景技术：
我国体外诊断产业现正处于快速增长时期。然而巨大的市场需求与我国诊断试剂行业相对落后的自主研发能力存明显的差距。如何从源头上开展自主创新，如何在诊断试剂原材料供应上不受制于个别境外医药巨头，如何将现有的生物医药领域的科研成果转化为产品是我国政府、科研院所和医药行业在近年来都非常关注的热点。并且现今市场上对更灵敏、高效的诊断试剂提出了刚性需求，能够快速准确的确诊结核病患者对于医务工作者和病人本人都具有重要意义。
近年来数据调查结果显示，有结核病症状的患者76.6％接受过结核病病前相关检查，但是仅有35.8％被诊断为肺结核患者，提高病人发现率仍是当前结核病防治工作的重点也是难点。
利用抗原特异性T细胞的细胞免疫反应进行病原微生物感染的体外诊断，是近年发展起来的一种新的检测方法。通过分离新鲜全血中的外周血单核细胞并进行刺激培养，然后利用ELISPOT检测能够分泌IFN-γ的细胞的数量。该方法目前主要应用于结核分枝杆菌感染的诊断。目前临床普遍采用的结核诊断主要依赖于临床症状、影响学诊断和病原学诊断，对结核分枝杆菌潜伏性感染的诊断不敏感。同时，在结核病筛查过程中，直接检测病原体或检测结核分枝杆菌抗体的灵敏度和特异性也不理想。
T-SPOT.TB是一种更简单的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测方法。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。这使得ELISPOT检测更加的灵敏，超过传统的ELISA实验。T-SPOT.TB被设计出来用于检测结核特异抗原刺激活化的效应T细胞。T-SPOT.TB记数每个活化的结核特异效应T细胞。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供Rv0054蛋白的用途。
本发明提供Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测结核分枝杆菌产品中的应用；
所述Rv0054是如下a)或b)的蛋白：
a)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中的序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与序列2所示蛋白具有相同功能的由a)衍生的蛋白质。
上述Rv0054蛋白在制备检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌产品中 的应用也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否感染结核分枝杆菌的产品。
本发明提供的产品，包括Rv0054蛋白。
上述产品还包括阳性质控和空白对照；
所述阳性质控为植物血凝素PHA；
所述空白对照为无抗原的细胞培养液。
上述产品中，所述产品还包括记载如下内容的可读载体：
若空白对照孔和检测孔的斑点数符合如下标准：空白对照孔的斑点数为0-5个，且检测孔的斑点数-空白对照孔的斑点数≥5，则待测样本感染或候选感染结核分枝杆菌；若空白对照孔和检测孔的斑点数不符合上述标准，则待测样本未感染或候选未感染结核分枝杆菌；
所述空白对照孔为空白对照所在孔，
所述检测孔为所述Rv0054蛋白所在孔。
上述产品为试剂盒，上述试剂盒具体为T-SPOT试剂盒，也可以为ELISA试剂盒。
上述T-SPOT试剂盒还包括T-SPOT试剂盒中的微孔培养板、浓缩标记抗体、显色底物溶液。上述试剂盒为Oxford immunotec(英国)的产品。
本发明第三个目的是提供一种用于鉴别、诊断、辅助诊断、筛查和/或辅助筛查结核分枝杆菌的标志物。
本发明提供的标志物，为Rv0054蛋白。
本发明的实验证明，本发明筛选了结核分枝杆菌来源的蛋白片段，提供了一种检测结核病的结核分枝杆菌标识物抗原RV0054，通过该抗原来体外检测特异性T细胞免疫反应，可以作为诊断结核病患者的参照，用于诊断患者是否被结核分枝杆菌感染。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
部分试剂如下：
lysis buffer：20mM Tris-HCl、500mM氯化钠、10％甘油、pH 8.0
Wash buffer：20mM Tris-HCl、20mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH 8.0
Elution buffer：20mM Tris-HCl、250mM咪唑、500mM氯化钠、10％甘油、pH8.0
层析缓冲液：取磷酸二氢钾13.609g(配制1000ml)，加0.1mol/l氢氧化钠溶液，调节pH至7.5，得到pH值为7.5的PBS缓冲液。
固化Ni+层析树脂Novagen，Ni-NTA His，(Cat.NO 70691-5，北京华美；2-8度保存)；蛋白结合能力大于5mg/ml resin层析柱(玻璃或者聚丙烯)。superdex 75：(GE)。
下述实施例采用结核感染T细胞检测试剂盒是Oxford immunotec(英国)的T-SPOT试剂盒，为ESAT-6和CFP 10双抗原试剂盒。
实施例1、原核表达目的蛋白Rv0054
目的蛋白Rv0054的制备：将表达Rv0054蛋白编码基因的重组载体pET28a-Rv0054导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv0054；再IPTG诱导重组菌BL21/pET28a-Rv0054，收集上清液，即为目的蛋白Rv0054。
具体如下：
1、表达目的蛋白重组菌的构建
Rv0054蛋白的氨基酸序列为序列2，其编码基因的核苷酸序列为序列1。
将序列1所示的Rv0054蛋白编码基因插入pET28a载体的NdeI和EcoRI位点，得到重组载体pET28a-Rv0054；
将重组载体导入大肠杆菌BL21中，得到重组菌BL21/pET28a-Rv0054。
2、蛋白表达
1)重组菌BL21/pET28a-Rv0054在37℃静置过夜(16h左右)。
2)接种于5ml液体LB培养基(加入5ul kan)37℃200rpm，培养至OD大于0.6-0.8(大约3h)。
3)按接种量5ml接种于300ml LB液体培养基中，37℃，200rpm培养至OD600≈0.6-0.8(大约2h)。降温到16℃，加入终浓度0.4mM IPTG；
4)16℃，200rpm培养培养16h，4℃，4000rpm离心10min收集菌体。
3、蛋白纯化
1)菌体重悬：每1L培养基所收集的菌体用40ml左右lysis buffer重悬(加入1％蛋白酶抑制剂PMSF，则终浓度为0.5-1mM)
2)菌体破碎：超声6s/次、功率为38％，超声20min。(悬浊液透亮为标准，酌情调整超声工作总时间)。
3)去除细菌碎片：4℃，12000g离心30分钟。
4)Ni柱处理：3mlNi柱先用水处理8cv(8倍柱体积)，再用8cv lysis buffer作为平衡液平衡，流速为30cm/h。
5)上样：破菌离心上清以30cm/ml的流速进行上样，收集流穿峰。
6)平衡：样品上样后用平衡液平衡5cv；
7)洗涤：用wash buffer洗涤5cv；
8)洗脱：用elution buffer洗脱，分管收集。用bradford试剂检测洗脱液，了解蛋白是否完全洗脱。如含有蛋白，则继续洗脱，直至完全，得到洗脱蛋白。
9)透析：洗脱蛋白装入7KD的透析袋中放入装有100倍洗脱蛋白体积的离子交换缓冲液A(配方10mM PB、50mM NaCl、pH 7.5)的烧杯中进行透析过夜。离心取上清。
10)分子筛层析
a)层析柱：superdex 75(根据样品的量来确定层析介质的体积)
b)流速；30cm/h
c)层析过程：先用水处理5cv，再用0.6M NaOH水溶液处理半小时，再用层析缓冲液(PBS、pH 7.5)平衡层析，直至层析柱电导和pH流出液与层析缓冲液一致。将上述9)得到的上清上样，用层析缓冲液洗脱(流速30cm/h)，收集对应的洗脱峰，为目的蛋白Rv0054(大小为19.516KDa)。
实施例2、结核分枝杆菌标识物抗原Rv0054在检测结核分枝杆菌中的应用
1、T-SPOT试剂盒检测
具体如下：
1)使用肝素真空采血管对不同待测患者(表1所示，且患者知情，已经临床确诊)直接采外周静脉血，得到抗凝血样本；
2)将抗凝血样本按体积1:1与RPMI1640培养液混匀；按3:1比例小心将血样加在Ficoll淋巴细胞分离液上层(利用Ficoll-PaqueTMplus按照操作说明分离PBMCs)；室温25℃，1000g离心22分钟；水平转子，缓升缓降；
3)将单核细胞层(位于离心管中间层，为一层较薄的白膜状)从Ficoll分离管中转移到已加10ml AIM-V培养液的无菌15ml离心管，轻轻混匀，室温600g离心7min；
4)小心去除上清，加入1ml AIM-V培养液，轻缓重悬细胞，加入AIM-V培养液至10ml,350g离心7min；
5)小心弃上清，加入1ml AIM-V培养液重悬细胞，得到细胞悬液(PBMCs)；
6)取10μl细胞悬液加入40μl的1％trypan blue，用AIM-V培养液稀释，得到细胞稀释工作液；
7)将24孔PVDF膜板从铝封袋中取出，按顺序加入：50μl植物血凝素PHA至阳性对照孔、50μl制备获得的Rv0054蛋白溶液(初始浓度为60ug/ml，溶剂为AIM V培养液)加入到检测孔、50μl AIM V培养液至空白对照孔；在上述3孔中分别加入已制备细胞稀释工作液100μl(每孔细胞数量2.5×105)，且样品孔中Rv0054蛋白溶液的终浓度为20ug/ml；
8)将培养板放入37℃，5％CO2培养箱孵育16小时；
9)用无菌PBS按1:200制备新鲜酶标抗体工作液。从培养箱取出培养板，弃去孔内液体。以200μl/well无菌PBS洗涤4遍；
10)加入50μl/well酶标抗体工作液，将培养板在2-8℃孵育1小时。用PBS洗涤4遍去除未结合酶标抗体；
11)每孔加入室温平衡过的底物工作液50μl，室温反应7分钟。以蒸馏水冲洗终止反应，在37℃2-3hrs或室温过夜干燥培养板，得到含有反应产物的培养板。
2、斑点记数
1)从培养箱中取出含有反应产物的培养板弃去细胞培养液；
2)每个反应孔加入200ul PBS缓冲液(pH 7.5)；
3)弃去PBS缓冲液；用新鲜的PBS缓冲液重复洗涤至少3遍；
4)用PBS缓冲液200倍稀释试剂盒中的浓缩标记抗体试剂(碱性磷酸酶标记的小鼠的抗人γ-干扰素单抗)；
5)每个反应孔加入50ul标记抗体工作液，2-8℃孵育1小时；
6)弃去标记抗体工作液，按上述的步骤2和3洗涤；
7)每个反应孔加入50ul底物显色溶液室温孵育7分钟；
8)用蒸馏水或去离子水彻底洗涤培养板终止反应；
9)在通风处或37℃温箱干燥培养板；
10)记数每个反应孔内深蓝色清晰的斑点。
结果判断：
若空白对照孔斑点数为0-5个，且(检测孔的斑点数-空白对照孔斑点数)≥5，则有反应，即待测样本与Rv0054产生免疫反应，待测样本候选感染结核分枝杆菌。
若不满足上述，则待测样本与Rv0054不产生免疫反应，待测样本候选未感染结核分枝杆菌。
用上述方法检测表1中18个待测样本(已经临床鉴定具体病及均感染结核分枝杆菌)，结果如表1所示。
采用试剂盒中自带的抗原ESAT-6和抗原CFP 10也对表1的18个样本进行检测，判断标准按照试剂盒说明书中：若空白对照孔斑点数为0-5个，且(检测孔的斑点数-空白对照孔斑点数)≥6，则有反应，即待测样本与抗原产生免疫反应，待测样本感染或候选感染结核分枝杆菌。若不满足上述，则待测样本与抗原不产生免疫反应，待测样本未感染或候选未感染结核分枝杆菌。
表1为样本及其检测结果
表中，-为空白对照，+为阳性质控。
可以看出，
Rv0054作为抗原检测，11个待测样本中8例为感染结核分枝杆菌的样本，这与临床鉴定结果一致；但是其余3个样本没有检测出来(用现有的ESAT-6蛋白和CFP-10蛋白以及临床检测，可以判断这5个样本也为结核分枝杆菌感染)，因此，本发明用Rv0054作为抗原检测是否感染结核分枝杆菌的检出率达73％。
从上述实验可以看出，Rv0054蛋白可以检测或辅助检测待测患者是否感染结核分枝杆菌，具体如下：以Rv0054蛋白作为抗原，通过结核感染T细胞检测试剂盒检测，以细胞培养基作为空白对照，若空白对照孔斑点数为0-5个，且(检测孔的斑点数-空白对照孔斑点数)≥5，则有反应，即待测样本与Rv0054产生或候选产生免疫反应，待测样本感染或候选感染结核分枝杆菌。若不满足上述，则待测样本与Rv0054不产生免疫反应，待测样本未感染或候选未感染结核分枝杆菌。