专利名称：鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及结核和非结核分枝杆菌检测领域，具体涉及检测结核和非结核分枝杆菌的方法及专用试剂盒。
背景技术：
结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的非结核分枝杆菌(NTM)引起的疾病称为非结核分枝杆菌病，可累及淋巴结、皮肤、软组织和肺。非结核分枝杆菌感染肺脏，引起肺部病变称为非结核分枝杆菌肺病。其中非结核分枝杆菌(NTM)在世界上报道的有150多种，其中命名了 M种，有致病性的分枝杆菌有37种，中国境内分离出了 20多种。NTM是一种环境分枝杆菌，大部分是腐物寄生菌，主要存在于自然环境中，现在普遍被接受的观点是，人可从环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径，人与人之间传播尚未得到证实，但可以通过动物传染给人。世界各国由于地理、环境、气候的不同，各国经济、文化水平、医疗技术水平的差异和对疾病的调查方法、标准不同，NTM病流行情况千差万别，但目前几乎是结核病倾向减少， NTM病有逐渐增加趋势。非结核分枝杆菌致病性特点(1)老年人身患多种疾病易发病。非结核分枝杆菌通常作为继发性或伴随性疾病， 感染具有机会性是此菌致病性的一个显著特点。往往在慢性阻塞性肺疾病、老年人、恶性肿瘤病人、肾透析、脏器移植时接受免疫抑制剂以及应用肾上腺皮质激素者，本病发生率增加。我们有1例90岁非结核分枝杆菌肺病患者，基础病为慢性阻塞性肺疾病、冠心病、血管性痴呆、前列腺肥大等多种疾病及长期机械通气反复肺部感染。(2)致病性低。一般认为NTM对人类的致病性比结核分枝杆菌低。刘敬东认为，全国感染NTM者估计在1亿以上，但发病者仅百余例。我病区同时期有9例患者使用呼吸机， 其中8例患者从痰中检测到抗酸杆菌，通过结核菌培养加菌种鉴定，其中7例患者无结核复合群。这8例患者中仅1例有明确的肺部阴影。(3)临床症状差异较大。一般认为NTM引起的肺部病变与肺结核十分相似，症状大多较轻，缺少特征性。一般表现为咳嗽、咳痰、低热和疲乏或偶有咯血，有些患者无明显临床症状和体征。因多数患者有肺部基础疾病，蓁咳嗽、咳痰的症状往往被误诊为基础疾病所致。(4)艾滋病及HIV感染者多发。在美洲和欧洲艾滋病病人中，发现50%患者感染分枝杆菌，其中10% 15%为鸟-胞内复合群分枝杆菌。(5)耐药率高。有报道非结核分枝杆菌的耐药率为95. 9%。结核病已成为全世界成人因传染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。分枝杆菌感染严重危害着广大人民群众的身体健康，已成为重大的公共卫生问题和社会问题。1997年我国第一次结核病流行病学抽样调查显示，8省市52万人痰菌培养阳性681份，经菌种鉴定四株为NTM，分离率为4. 3%。1990年第三次全国结核病流行病学抽样调查结果显示，NTM感染率为15. 35%，浙江省最高为44. 89%。2000年全国流调中NTM菌株占11. 1%。当前，我国结核感染防控面临两大问题一是结核多药耐药(MDR)的产生与传播， 使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向，MDR是结核病高病死率的主要原因之一；二是非结核分枝杆菌(NTM)所引发的疾病发病率增加，越来越为人们所关注。由于传统的检测方法需要6到8周才能得到结果，延误了病人的早期治疗，使病人处于盲目用药状态。大量研究以及临床治疗病例表明多数传统抗痨药对非结核分枝杆菌病(NTM)病很少或没有疗效，因此，对结核分枝杆菌复合群和非结核分枝杆菌的区分检测对指导临床治疗有着重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，进行荧光定量PCR检测，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定结核和非结核分枝杆菌。本发明提供的技术方案为提供一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针，其特征在于，所述引物为上游引物 MFl和下游引物MRl或上游引物MF2和下游引物MR2，所述引物能与分枝杆菌的特异片段结合，所述用于检测分枝杆菌设计的探针1其序列为M1、M2、M3中的任意一个，用于检测结核分枝杆菌设计的探针2序列为T1、T2、T3中的任意一个，所述探针1和探针2的3’端带有淬灭物质，所述探针1和探针2的5’端的荧光物质不同，所述上游引物MFl的核苷酸序列为序列表中的序列1 ；所述下游引物MRl的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；所述上游引物MF2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；所述下游引物MR2的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；所述探针Ml的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；所述探针Μ2的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；所述探针Μ3的核苷酸序列为序列表中的序列7 ；所述探针Tl的核苷酸序列为序列表中的序列8 ；所述探针Τ2的核苷酸序列为序列表中的序列9 ；所述探针Τ3的核苷酸序列为序列表中的序列10。优选的，所述引物为上游引物MFl和下游引物MR1，所述用于检测分枝杆菌属设计的探针为探针Μ3，用于检测结核分枝杆菌设计的探针为探针Τ3。优选的，所述探针1的5’端标记HEX，探针2的5’端标记荧光物质FAM，探针1和探针2的3’端都是标记淬灭物质BHQ。优选的，所述特异片段为16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列(ITS序列)的变异区，所述16S rRNA和23S rRNA为分枝杆菌和非结核分枝杆菌按沉降系数分类的rRNA。本发明提供的另一个技术方案为提供一种鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤用权利要求1至4中任一项所述的鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果同时检测到探针1和探针2的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果能检测到探针1的荧光信号，而不能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。本发明的有益效果为利用了不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，利用双通道荧光定量的优点，能够一次性区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的荧光定量核酸检测技术，该技术是目前能同时区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的荧光定量PCR检测技术，检测时间短，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确，更可靠。解决了传统鉴定方法中通过细菌的生长形态来区分需耗时长达4-6周的问题。
图1 :10倍梯度稀释结核分枝杆菌核酸和其他阴性样本为模板进行扩增样本荧光定量PCR检测结果图；图2 10倍梯度稀释至lOOOOcopies/mL的结核分枝杆菌样品和其它菌株样本进行检测结果图。
具体实施例方式细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5s、16s和23s rRNA。16srdna和23s rRNA 是细菌染色体上编码16s rRNA和23s rRNA相对应的dna序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。而16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列(its序列)的变异区可以充分区分各种分枝杆菌，是进行分枝杆菌的菌种鉴定最理想的区域，可以用来鉴别结核分枝杆菌；同时保守区域又极端保守，能够识别分枝杆菌属，因此， 我们的产品选取16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列(its序列)作为我们的目的基因片段，根据保守区域和可变区域同时设计不同的探针来同时检测，用于鉴别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。根据分枝杆菌的16s rRNA和23s rRNA之间的插入序列所处的特殊位置，我们在探针的上游和下游分别设计引物，根据公知技术引物设计原则分别设计两条上游引物和两条下游引物，通过试验选取其中扩增效率最高的一对引物作为该专利技术使用引物。设计的两对引物如下
权利要求
1.一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针，其特征在于，所述引物为上游引物MFl和下游引物MRl或上游引物 MF2和下游引物MR2，所述引物能与分枝杆菌的特异片段结合，所述用于检测分枝杆菌设计的探针1其序列为Ml、M2、M3中的任意一个，用于检测结核分枝杆菌设计的探针2序列为 T1、T2、T3中的任意一个，所述探针1和探针2的3’端带有淬灭物质，所述探针1和探针2 的5’端的荧光物质不同，所述上游引物MFl的核苷酸序列为序列表中的序列1 ； 所述下游引物MRl的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 所述上游引物MF2的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述下游引物MR2的核苷酸序列为序列表中的序列4 ； 所述探针Ml的核苷酸序列为序列表中的序列5 ； 所述探针Μ2的核苷酸序列为序列表中的序列6 ； 所述探针Μ3的核苷酸序列为序列表中的序列7 ； 所述探针Tl的核苷酸序列为序列表中的序列8 ； 所述探针Τ2的核苷酸序列为序列表中的序列9 ； 所述探针Τ3的核苷酸序列为序列表中的序列10。
2.根据权利要求1所述鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述引物为上游引物MFl和下游引物MR1，所述用于检测分枝杆菌属设计的探针为探针Μ3，用于检测结核分枝杆菌设计的探针为探针Τ3。
3.根据权利要求2所述鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述探针1 的5’端标记HEX，探针2的5’端标记荧光物质FAM，探针1和探针2的3’端都是标记淬灭物质BHQ。
4.根据权利要求1所述鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，其特征在于，所述特异片段为16S rRNA和23S rRNA之间的插入序列(ITS序列)的变异区，所述16S rRNA和23S rRNA为分枝杆菌和非结核分枝杆菌按沉降系数分类的rRNA。
5.一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤用权利要求1 至4中任一项所述的鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，对待测菌株的核酸进行荧光定量PCR扩增，检测所得到的PCR产物的荧光信号；如果同时检测到探针1和探针2的荧光信号，则待测菌为结核分枝杆菌；如果能检测到探针1的荧光信号，而不能检测到探针2的荧光信号，则待测菌为非结核分枝杆菌。
全文摘要
本发明是利用双通道荧光定量的优点，能够一次性区分鉴别结核和非结核分枝杆菌的荧光定量核酸检测技术，检测时间短，检测结果可靠而且能够定量。本发明的技术方案为提供一种鉴别结核和非结核分枝杆菌的试剂盒，包括对待测菌株进行PCR扩增的引物和荧光定量检测的探针。本发明通过不同分枝杆菌的基因序列的差异来设计荧光探针，区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，从细菌的基因序列和分子结构水平来区分和鉴定，分类更准确，更可靠。解决了传统鉴定方法中通过细菌的生长形态来区分需耗时长达4-6周的问题。
文档编号C12Q1/68GK102229999SQ20111014625
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者任维, 张新丽, 曲敬, 邹耀东 申请人:亚能生物技术(深圳)有限公司