结核分枝杆菌pcr-lfb检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了结核分枝杆菌PCR?LFB检测试剂盒，是在对结核分枝杆菌复合群IS6110基因序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性寡核苷酸引物和一对经特定标记的寡核苷酸探针，利用PCR技术结合侧向流生物传感器对结核分枝杆菌进行检测。此技术仅需要常规的PCR仪和一次性侧向流生物传感器便能完成对临床样本的检验，将分子诊断技术在专业医疗检测机构，尤其是基层医疗机构推广，具有潜在的应用价值。检测时间周期短、检测效率高；检测特异性强，准确率高；在进行病原体定性分析是其检测灵敏度名显高于普通PCR检测方法；操作简单、易于推广；实验结果重复性好。
【专利说明】
结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒
[0001 ]
技术领域： 本发明属病原体检测领域，具体涉及结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒。
[0002]
【背景技术】： 结核病(tuberculosis，TB)作为一种人重大传染性疾病，威胁着人类的生命安全。全世 界每年新发结核病例约有1000万，死亡人数约有200万。在我国每年新增患者数约200万，死 亡人数约25万。截止到2013年，全球约有900万人患结核病，其中中国患者约占总数的11%; 此外还有150万结核病患者死亡，其中包括36万人为结核病和艾滋病毒共感染患者。
[0003] 结核病的检测方法主要有临床诊断、病原学诊断、血清学诊断、分子生物学诊断等 方法。然而临床诊断准确度低;病原学诊断涂片阳性率低;血清学诊断成本高，对操作者要 求高，对实验室设备要求也高，同时，该方法也不利于传染病的早期诊断。现在常用且检测 准确度高的方法主要是借助PCR手段的分子生物学诊断。常规PCR技术，在操作过程中需要 琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增物进行检测，该方法操作复杂、设备投入高，同时需要核酸染料 EB，从而增加了对实验环境的污染。鉴于以上原因，常规PCR技术尚不能作为常规检测技术 被广泛应用。随着技术的进步，荧光定量PCR(qPCR)技术由于具有检测快速、灵敏度高等优 点被越来越多的应用于传染病的早期检测。但该技术需要昂贵的定光定量PCR仪，并且需要 专业人员来操作。目前，其应用主要集中在发达国家或有条件的专业检测机构，这就极大地 限制了该技术的推广及应用。
[0004] 本研究利用一种一次性侧向流生物传感器实现对检测核酸扩增物的检测，检测结 果通过肉眼即可判读，时间少于5分钟。灵敏度是常规电泳法的100倍以上。该技术摆脱了核 酸检测对昂贵设备(如电泳仪、荧光检测仪)和对专业化人员的依赖。这为专业实验室，基层 实验室、开展结核分枝杆菌的检测提供了新思路。
[0005]
【发明内容】
： 本发明的目的是为了解决结核分枝杆菌检测设备昂贵，不利于推广的问题，而提一种 结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒。
[0006] 结核分枝杆菌特异性寡核苷酸引物和经特定标记的寡核苷酸探针， 它的引物序列： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 '。
[0007] 修饰寡核苷酸探针为： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3，。
[0008] 结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒，它包括：引物、探针和侧向流生物传感器，所述 的引物、探针为上述的结核分枝杆菌特异性寡核苷酸引物和经特定标记的寡核苷酸探针； 所述的侧向流生物传感器是由下述方法制备的： 1 )30nm胶体金制备:在525nm有最大吸收峰（紫外扫描光谱），0D值为0.882，氯金酸:柠 檬酸三钠1:1.25; 2) 胶体金与链霉亲和素标记：以标记lmL胶体金为例，加入14yL 0.2M K2CO3混匀，使胶 体金pH在SA等电点附近;加入lyL浓度为lOyg/yl的SA，手摇混匀lOmin;加入20yL10% BSA封 闭 lOmin，再加入20yL10% PEG20000封闭 lOmin，4° C，7000rpm，离心 15min，去上清，用（10mM PBS+0.5% Triton X-100+0.3% BSA，pH 7.4的复溶液按原体积复溶，金标结合垫切成0.9cm X 30cm大小，用移液器将复溶后的标记物铺在金标结合垫上，37° C干燥3-4小时，备用。每根 膜条处理量为1.809mL; 3) 样品垫处理:样品垫切成1.7cmX30cm大小，用移液器将配制好的样品垫处理液铺在 样品垫上，37°C烘干，每根膜条处理量为3.417mL; 4) 活化的Biotin与BSA偶联：Sulfo-NHS-Biotin与BSA按摩尔比为20:1于4°C偶联过 夜。0.2μπι微孔滤膜过滤，随后划于硝酸纤维素膜质控线--C线上。具体操作步骤为：称取 O.lg BSA溶于 10 mL PBS缓冲液中，调节ρΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混匀，并于4°C条件下，搅拌偶联过夜;0 · 22μπι过滤，-20°C保存。
[0009] 5)控制线制备：硝酸纤维素膜一NC膜上C线标记偶联好的Biotin，按比例稀释成 1 · 0mg/mL，按lyL/cm划在NC膜上，37 °C干燥3-4小时，备用。
[0010] 6)检测线制备:NC膜上检测线一T线，标记Rabbit anti-FAM，按lyL/cm划在NC膜 上，37°C烘干。
[0011] 7)试纸条组装:取PVC底板作为试纸条的支撑，粘面至上，将上述准备好划有C线、T 线的NC膜粘在中央位置，然后粘贴胶体金结合垫使其压在NC膜末端下方2_处，将样品垫粘 贴在试纸条最下端，最后粘贴吸水纸在PVC底板的最上端，使其尾部压在NC膜上。
[0012] 本发明提供了结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒，是在对结核分枝杆菌复合群 IS6110基因序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性寡核苷酸引物和一对 经特定标记的寡核苷酸探针，利用PCR技术结合侧向流生物传感器对结核分枝杆菌进行检 测。此技术仅需要常规的PCR仪和一次性侧向流生物传感器便能完成对临床样本的检验，将 分子诊断技术在专业医疗检测机构，尤其是基层医疗机构推广，具有潜在的应用价值。
[0013] 本试剂盒主要包括结核分枝杆菌DNA提取方法、针对结核分枝杆菌的一对特异性 引物、两条特定标记的核酸探针、阳性对照、阴性对照、PCR Buffer、侧向流生物传感器及其 配套的缓冲液。
[0014] 本发明所涉及检测基本原理(如图1所示）：PCR扩增结束后(扩增复合物两端分别 被Biotion和FAM标记），取10yL PCR扩增物与90yL展开液在酶标板中充分混匀，形成待测 液。将制备好的侧向流生物传感器下部样品垫浸入酶标板待测液中。扩增复合物中的 Biotin位点与金标垫中链霉亲和素-纳米金复合物结合，形成新的复合物。随待测液自下而 上层析，当到达T线时被抗-FAM单克隆抗体所捕获，形成三明治结构。最后，由于反应过程中 纳米金颗粒在T线处的富集，产生肉眼可见的红色条带;过剩的纳米金-链霉亲和素继续层 析至C线被Biotin捕获，形成肉眼可见的红色条带，此时检测结果为阳性。若只有质控线呈 红色，检测结果为阴性。若T线和C线均为无色条带，表明该生物传感材料已失效。
[0015] 本发明的优点： 检测时间周期短、检测效率高;检测特异性强，准确率高;在进行病原体定性分析是其 检测灵敏度名显高于普通PCR检测方法;操作简单、易于推广;实验结果重复性好。
[0016]
【附图说明】： 图1.检测基本原理示意图； 图2. 30nm胶体金的吸收光谱图； 图3.侧向流生物传感器的组装结构图； 图4.结核分枝杆菌PCR-LFB法的特异性检测结果； 图5.结核分枝杆菌PCR-LFB法的灵敏性检测结果。
[0017]【具体实施方式】： 实施例1结核分枝杆菌鉴定特异性核酸序列的设计及合成 根据结核分枝杆菌复合群共有的插入序列IS6110基因设计特异性寡核苷酸引物。引物 序列如下： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 '。
[0018]用于与IS6110扩增片段杂交的修饰寡核苷酸探针为： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3，。
[0019]以上引物及探针的特异性通过NCBI网站Blast工具软件进行分析，证明该序列与 核酸数据库中其它序列不存在交叉反应，初步证明其针对结核分支杆菌具有特异性。寡核 苷酸引物、探针由上海生工生物工程有限公司合成。扩增基因序列如SEP ID NO. 1所示. 实施例2侧向流生物传感器的制备 (l)30nm胶体金制备：在525nm有最大吸收峰（紫外扫描光谱），如图2所示，0D值为 0.882，氯金酸:柠檬酸三钠1:1.25。
[0020] (2)胶体金与链霉亲和素（SA)标记：以标记lmL胶体金为例，加入14yL 0.2M K2C〇3 混匀，使胶体金pH在SA等电点附近；加入lyLSA(lOygAU)，手摇混匀lOmin;加入20yL10% BSA封闭lOmin，再加入20yL10% PEG20000封闭lOmin，4° C，7000rpm，离心 15min，去上清，用 复溶液（10禮？83+0.5%1^丨〇11乂-100+0.3%834，？!17.4)按原体积复溶，金标结合垫切成 0.9cm X 30cm大小，用移液器将复溶后的标记物铺在金标结合垫上，37° C干燥3-4小时，备 用。每根膜条处理量为1.809mL。
[0021] (3)样品垫处理:样品垫切成1.7cmX 30cm大小，用移液器将配制好的样品垫处理 液铺在样品垫上，37 °C烘干，备用。每根膜条处理量为3.417mL。
[0022] (4)活化的Biotin与BSA偶联：Sulfo-NHS-Biotin与BSA按摩尔比为20:1 于4°C偶 联过夜。0.2μπι微孔滤膜过滤，随后划于硝酸纤维素膜质控线(C线)上。具体操作步骤为:称 取O.lg BSA溶于 10 mL PBS缓冲液中，调节ΡΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混匀，并于4°C条件下，搅拌偶联过夜;0 · 22μπι过滤，-20°C保存。
[0023] (5)控制线制备：硝酸纤维素膜(NC膜)上C线标记偶联好的Biotin，按比例稀释成 1 · 0mg/mL，按lyL/cm划在NC膜上，37 °C干燥3-4小时，备用。
[0024] (6)检测线制备:NC膜上检测线（T线）标记Rabbit anti_FAM(lmg/mL)按lyL/cm划 在NC膜上，37 °C烘干，备用。
[0025] (7)试纸条组装:取PVC底板作为试纸条的支撑，粘面至上，将上述准备好划有C线、 T线的NC膜粘在中央位置，然后粘贴胶体金结合垫使其压在NC膜末端下方2mm处，将样品垫 粘贴在试纸条最下端，最后粘贴吸水纸在PVC底板的最上端，使其尾部压在NC膜上，组装完 成，如图3所示。
[0026]实施例3结核分枝杆菌的检测方法 (1)患者痰标本的处理及结核分枝杆菌DNA提取:加入2倍痰液体积的4%氢氧化钠溶液， 振荡混匀，室温放置30min，期间振荡混匀，使其充分液化;6000 X g离心10 min，弃上清;加 1.5 mL 0.01mol/L PBS (pH 7.8)，充分振荡混匀。6000Xg离心10 min,弃上清。收集沉淀 物，加入 100yL DNA提取液（10 mmol Tris，150mmol NaCL，0.01% Triton Χ-100,0·05% Tween 20，200此/仙蛋白酶K)充分振荡混匀，60°C水浴15min; 95°C加热5 min，瞬时离心；加 等体积三氯甲烷，振荡混匀，12 000Xg离心5 min;取上清5yL，直接用于PCR扩增。
[0027] (2)PCR扩增反应程序： PCR反应体系组成：10XPCR缓冲液，0.2 mM dNTP，0.5 μπιο?各引物及探针，lyL模板 DNA，0.5 U ragDNA聚合酶，DDW补至总体积为25μΙ^ΡΟ?反应条件:95°C预变性30s;95°C变 性5s，59 °C退火延伸15s，共40个循环;随后，95 °C变性5s，50 °C退火延伸15s，共5个循环，4 °C 保存。
[0028] (3)侧向流生物传感器对PCR扩增物的检测:PCR扩增结束后，取10yL扩增产物于生 物传感器的下部样品垫上，随后将生物传感器下部放入90yL的展开液（0.01 M PBS，pH 7.4)中，5min后读取结果，质控线和检测线呈红色，结果为阳性;若仅质控线呈红色，结果为 阴性，若两条线都无色则判读无效。
[0029] 实施例4试剂盒特异性检测 分别对牛型结核分支杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、酵母菌、单增李斯特 菌的基因组DNA，用上述的PCR-LFB方法进行检测。结果表明，只有结核分支杆菌基因组DNA 检测结果呈阳性，而其它非目的菌的检测结果均呈阴性，说明该方法对结核分枝杆菌的检 测具有特异性，如图4所示。
[0030] 实施例5试剂盒灵敏性检测 提取结核分支杆菌DNA，测定其初始浓度，对其进行梯度稀释。每个反应中核酸浓度依 次为l〇ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg。以上述浓度DNA作为模板分别进行PCR扩 增，并采用琼脂糖凝胶电泳和PCR-LFB进行对比检测。结果表明，电泳法的最低检测限为 lpg，而PCR-LFB最低检测限为10f g，如图5所示。
[0031 ]实施例6结核分枝杆菌特异PCR-LFB法的临床样本检测 采用本发明的方法和试剂盒对54份临床痰液样本进行检测，与培养法和涂片法进行比 较。在54份标本中，PCR-LFB检测阳性率为75.9%，显著高于涂片法的16.7%和培养法的 24.1 %。在9份培养阳性的标本中，PCR法检测全部阳性，两者阳性复合率为100%，如表1所示。
[0032] 实施例7 采用本发明的方法和试剂盒，选用本发明设计的引物与已报道的针对IS6110的基因 (基因序列如SEPIDN0.2所示）的特异引物(上游引物:5'-CGATCGTGGTCCTGC-3'，下游引 物:5 '-AACTACGGTGTTTACGGTGC -3'）进行检测比较。本发明筛选的引物序列，对结核分枝 杆菌检出具有较高的敏感性。对54份临床痰液样本进行检测，其检测阳性率为75.9%，而已 报道引物序列对这54份标本检测的阳性率仅为61.3%。
【主权项】
1. 结核分枝杆菌特异性寡核苷酸引物和经特定标记的寡核苷酸探针， 它的引物序列： 上游引物:5-CGATCGTGGTCCTGC-3 '， 下游引物：5 ' -AACTACGGTGTTTACGGTGC-3 ' ； 修饰寡核苷酸探针为： PI:5，-GCGGCAAAGC-FAM-3，； P2: 5-Biotin-GAGGGCATCGA-3 '。2. 结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒，它包括：引物、探针和侧向流生物传感器，其特征 在于:所述的引物、探针为权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性寡核苷酸引物和经特定标 记的寡核苷酸探针。3. 根据权利要求2所述的结核分枝杆菌PCR-LFB检测试剂盒，其特征在于:所述的侧向 流生物传感器，是由下述方法制备的： 1 )30nm胶体金制备:在525nm有最大吸收峰（紫外扫描光谱），0D值为0.882，氯金酸:柠 檬酸三钠1:1.25; 2) 胶体金与链霉亲和素标记：以标记lmL胶体金为例，加入14yL 0.2M K2CO3混匀，使胶 体金pH在SA等电点附近;加入lyL浓度为lOyg/yl的SA，手摇混匀lOmin;加入20yL10% BSA封 闭 lOmin，再加入20yL10% PEG20000封闭 lOmin，4° C，7000rpm，离心 15min，去上清，用（10mM PBS+0.5% Triton X-100+0.3% BSA，pH 7.4的复溶液按原体积复溶，金标结合垫切成0.9cm X 30cm大小，用移液器将复溶后的标记物铺在金标结合垫上，37° C干燥3-4小时，备用;每根 膜条处理量为1.809mL; 3) 样品垫处理:样品垫切成1.7cmX30cm大小，用移液器将配制好的样品垫处理液铺在 样品垫上，37°C烘干，每根膜条处理量为3.417mL; 4) 活化的Biotin与BSA偶联：Sulfo-NHS-Biotin与BSA按摩尔比为20:1于4°C偶联过 夜； 0.2μπι微孔滤膜过滤，随后划于硝酸纤维素膜质控线--C线上；具体操作步骤为：称取 O.lg BSA溶于 10 mL PBS缓冲液中，调节ρΗ7.4;加入5mg Sulfo-NHS-Biotin于3.7mL BSA 中，混匀，并于4°C条件下，搅拌偶联过夜;0· 22μπι过滤，-20°C保存； 5) 控制线制备:硝酸纤维素膜一NC膜上C线标记偶联好的Biotin，按比例稀释成l.Omg/ mL，按lyL/cm划在NC膜上，37 °C干燥3-4小时，备用； 6) 检测线制备:NC膜上检测线一T线，标记Rabbit anti-FAM，按lyL/cm划在NC膜上，37 °C烘干； 7) 试纸条组装:取PVC底板作为试纸条的支撑，粘面至上，将上述准备好划有C线、T线的 NC膜粘在中央位置，然后粘贴胶体金结合垫使其压在NC膜末端下方2mm处，将样品垫粘贴在 试纸条最下端，最后粘贴吸水纸在PVC底板的最上端，使其尾部压在NC膜上。
【文档编号】C12Q1/68GK105936941SQ201610521609
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】尹锐, 王康宇, 孙亚娟, 王艳芳, 王 义, 张美萍, 孙春玉, 于双, 贤加欢
【申请人】吉林农业大学