用于诊断结核分枝杆菌感染的分子标志物、引物组及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别设及用于诊断结核分枝杆菌感染的分子标志物及 在结核分枝杆菌感染诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 结核病（Tuberculosis ,ΤΒ)是因结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis , Mtb)感染引起的一种"高感染率"、"高致病率"与"高致死率"烈性传染病。2015年世界卫生 组织(WHO)发布的世界结核年报显示，结核病的年致死人数达到150万，已经超过因艾滋病 或HIV感染所致死人数。中国是全球结核分枝杆菌携带人数最多、活动性结核病人最多W及 结核耐药疫情最为严重的国家之一。所W，迅速控制结核疫情蔓延迫在眉睫。
[0003] 早期、快速、便捷诊断结核是控制结核病的一个关键环节。只有早期、快速、便捷、 准确诊断出是否被结核分枝杆菌感染，才能为临床治疗用药提供依据，才能为结核病控制 部口采取及时、快速的公共卫生防控措施提供决策依据。
[0004] 目前的结核分枝杆菌感染诊断技术主要包括有细菌学诊断与免疫学诊断。其中细 菌学诊断包括结核分枝杆菌疲涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养、及疲标本的结核分枝杆 菌特异核酸PCR检测等。但是，基于疲标本抗酸染色、培养、PCR的结核分枝杆菌细菌学诊断 技术严重依赖于结核病人排出的疲液里面必须有结核分枝杆菌。然而，有>50%的结核感 染病人因不排疲或者排的疲里面不含结核分枝杆菌所W无法在疲液里面检测到结核分枝 杆菌，而且结核分枝杆菌不仅培养周期非常漫长，往往需要3~6周，而且培养要求高。所W， 结核分枝杆菌感染的细菌学诊断技术具有很大的局限性，存在诊断效率低、周期长、灵敏度 低、技术复杂等缺陷，而且无法适用于临床约>50%的疲标本结核分枝杆菌阴性结核病人 的诊断。
[0005] 结核的免疫学诊断技术主要包括结核菌素皮试(TST)与IFN-丫释放的化ISA或者 ELISP0T检测。结核菌素皮试(TST)的主要优点是价格相对低廉、适宜大规模结核感染人群 的结核筛查。但是，结核菌素皮试(TST)的诊断缺乏结核分枝杆菌特异性，而且结核菌素皮 试(TST)的结果非常容易受到机体免疫力与生理状态的非特异性干扰。所W结核菌素皮试 (TST)存在诊断特异性差、灵敏度低的致命缺点。基于结核分枝杆菌特异的IFN-丫释放的 ELISA或者化ISP0T检测的结核免疫学诊断技术相比结核菌素皮试(TST)诊断技术有更高的 特异性。但是，基于结核特异的IFN-丫释放化ISA或者化ISP0T检测的结核免疫学诊断技术 需要专业的细胞培养实验室对受试者的细胞进行培养，细胞培养实验周期长，ELISP0T的数 据读出需要专业、昂贵的化ISP0T斑点读出仪器，总体诊断价格昂贵，不适用于基层的结核 早期、快速诊断，也不适合婴幼儿的结核诊断。而且，大量的结核病人处于免疫抑制或素乱 状态，IFN- 丫的表达受到抑制或者处于素乱的状态，所W，基于结核特异的IFN- 丫释放的结 核诊断技术存在技术上天然的缺陷。
[0006] 因此，发现新的结核特异的诊断生物标记物，开发灵敏、方便、快捷、特异性高并且 廉价的结核诊断新技术就成为了控制结核疫情蔓延的重要工作。
【发明内容】
[0007]为弥补现有技术的不足，本发明第一方面提供用于诊断结核分枝杆菌感染的新型 分子标志物，所述分子标志物选自序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA中的一种或两种W上 的组合。
[000引或者，所述分子标志物选自与SEQ ID NO.1~28所示的任何其中一种RNA的片段具 有相同序列或者>50%相同序列的RNA;或者所述分子标志物是与SEQ ID NO. 1~28所示的 任何其中一种RNA全长或片段具有>50%的RNA序列相似性的人工合成、拼接、重组或克隆 的 RNA。
[0009] 本发明第二方面提供上文所述的分子标志物在制备用于诊断结核分枝杆菌感染 的制剂中的应用。作为一种具体方式，该制剂通过检测被试者末梢血、外周血、外周血血清 或外周血单个核细胞(PBMC)中所述分子标志物的含量，并与正常水平相比较来诊断被试者 是否被结核分枝杆菌感染。进一步具体的，可通过实时定量PCR或基因忍片来检测判别被试 者是否被结核分枝杆菌感染。
[0010] 本发明第Ξ方面提供一种引物组，该引物组包括分别用于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物对中的至少一种引物对或两种W上引物对的组合，其中，用 于特异性扩增序列如SEQ ID N0.1~5、7-17、19-24、26-28所示的1?^4的引物对分别依次为 引物对1~5、7-17、19-24、26-28，用于特异性扩增序列如560 1〇^.6的1?^4的引物对为引 物对6a或6b，用于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 18的RNA的引物对为引物对1&1或18b，用于 特异性扩增序列如SEQ ID NO. 25的RNA的引物对为引物对25a或25b。引物对可W是天然的 或是合成的。
[0011] 本发明第四方面提供上述引物组在制备用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂中的 应用。
[0012] 本发明第五方面提供一种用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂，该制剂包括分别用 于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物对中的至少一种引物对、或两种W 上引物对的组合。进一步，用于特异性扩增序列如沈Q ID N0.1~5、7-17、19-24、26-28所示 的RNA的引物对分别依次为上文所述的引物对1~5、7-17、19-24、26-28，用于特异性扩增序 列如SEQ ID NO.6的RNA的引物对为引物对6a或6b，用于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 18的 RNA的引物对为引物对18a或18b，用于特异性扩增序列如SEQ ID NO.25的RNA的引物对为引 物对扣3或2513。该制剂可W是试剂盒或基因忍片等。
[0013] 本发明第六方面提供一种用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂，该制剂包括：1)外 周血单个核细胞(PBMC)的总RNA提取试剂;2)逆转录试剂;3)实时定量PCR试剂;其中，所述 实时定量PCR试剂包括用于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA的引物对中的至 少一种引物对、或两种W上引物对的组合。进一步优选的，用于特异性扩增序列如SEQ ID ^.1~5、7-17、19-24、26-28所示的3酷的引物对分别依次为上文所述的引物对1~5、7-17、 19-24、26-28,用于特异性扩增序列如SEQ ID ^.6所示的1?^4的引物对为引物对6曰或613，用 于特异性扩增序列如SEQ ID NO. 18所示的RNA的引物对为引物对1&1或18b，用于特异性扩 增序列如SEQ ID NO. 25所示的RNA的引物对为引物对25a或25b。该制剂中的外周血单个核 细胞的总RNA提取试剂和逆转录试剂均可采用本领域现有的相应试剂，如逆转录试剂采用 化ermo公司的逆转录试剂盒，总RNA提取试剂采用化i zo 1法提取RNA所需的常用试剂。该制 剂可W是试剂盒等。
[0014] 经实验证实，本发明所述的序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA在被结核分枝杆菌 感染的结核病患者中的表达量明显低于或高于未被结核分枝杆菌感染的健康人，因而，所 述的序列如SEQ ID NO. 1~28所示的RNA可W作为判别是否被结核分枝杆菌感染的特异分 子标志物或诊断祀点，可应用于制备用于诊断结核分枝杆菌感染的制剂中。采用本发明的 分子标志物开发诊断结核分枝杆菌感染的制剂，用于诊断结核分枝杆菌感染，具有灵敏、方 便、快捷、特异性高、廉价的特点。
【附图说明】
[0015] 图1:为序列如SEQ ID N0.1~8、10~17所示的RNA在结核分枝杆菌感染的结核病 患者或未被结核分枝杆菌感染的健康人群的人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的实 时定量PCR结果图；
[0016] 图2:为序列如SEQ ID顯.18~25、27~28所示的3酷在结核分枝杆菌感染的结核 病患者或未被结核分枝杆菌感染的健康人群的人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的 实时定量PCR结果图。
[0017] 图3:为序列如SEQ ID NO.9、26所示的RNA在结核分枝杆菌感染的结核病患者或未 被结核分枝杆菌感染的健康人群的人外周血单个核细胞(PBMC)中差异表达的实时定量PCR 结果图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明：
[0019]实施例
[0020]本实施例将人群分为两个组：结核分枝杆菌感染的结核病患者（27例，简写为TB 组）、未被结核分枝杆菌感染的健康人群(26例，简写为化althy组）；通过实时定量PCR检测 每例外周血单个核细胞(PBMC)中28种RNA(其序列如SEQ ID NO. 1-28所示）的表达情况，发 现结核分枝杆菌感染的结核病患者中上述28种RNA的表达水平总体明显低于或高于未被结 核分枝杆菌感染的健康人群。具体步骤如下：
[0021 ]步骤一:外周血单个核细胞(PBMC)悬液的制备：