结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗结核分枝杆菌潜伏感染制剂中的用图
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗结核分枝杆菌潜伏感染制剂中的用途。经研究表明，所述的Rv0324在结核分枝杆菌进入到潜伏状态的过程当中具有重要的生物学功能，与正常生长的结核分枝杆菌相比，该Rv0324基因的高表达能抑制结核分枝杆菌的生长。本发明还公开了以该基因为靶标检测潜伏期结核病的试剂盒以及以该基因构建的预防及治疗潜伏感染结核分枝杆菌的疫苗。
【专利说明】
结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗结核分枝杆菌潜伏感染制剂中的用途
技术领域
[0001]本发明属生物技术领域，结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗结核分枝杆菌潜伏感染制剂中的用途。本发明还涉及以此基因构建的预防及治疗潜伏感染结核分枝杆菌的疫苗。
【背景技术】
[0002]现有技术公开了结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌。据世界卫生组织的报道，世界上有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，每年有至少300万人死于该病。结核病至今仍为十分重要的传染病。研究显示，结核分枝杆菌能在宿主细胞内长期潜伏，它对缺氧条件的有着很好适应。感染了宿主之后，结核分枝杆菌将会很快进入休眠状态，待宿主的免疫系统发生缺陷时，便会攻击宿主。大部分的感染者都是处于休眠期的结核分枝杆菌，而这个比例随着人口的增长还在不停的增长当中。
[0003]目前，结核病的临床诊断主要有痰结核分枝杆菌检查、结核菌素实验。其中，分枝杆菌菌型的鉴定常根据培养特征(菌落形态等)和一系列的生化反应来确定。由于分枝杆菌的生化反应经常发生变化，这为其鉴定带来了不确定性。潜伏期的结核分枝杆菌往往更难以在临床上鉴定出来。因此寻找可以鉴定潜伏期结核病的诊断靶，对于结核病的早期诊断和治疗有着重要的意义。
[0004]结核分枝杆菌Rv0324基因是结核分枝杆菌的一个金属调控蛋白，属于arsR家族。研究显示，在潜伏状态下的结核分枝杆菌中Rv0324的表达量会有明显提高，并且将Rv0324高表达之后，会抑制结核分枝杆菌的生长。因此检测Rv0324的表达量对于结核病的早期诊断、治疗都有着潜在的价值。
[0005]传统的基因检测技术主要运用聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法大量扩增待测基因，然后通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳定量待测基因。以上方法有着极高的高灵敏度，但基于PCR反应的特点，反应终点的产物量往往无法正确反映反应初始阶段DNA的含量，因此存在定量不够精确，同时其检测的分辨率也不高，DNA的量的差异如果低于五倍，往往检测不出等缺陷。近年来不断完善的实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号的积累监控整个PCR的进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA精确定量。由于只对指数期反应的产物进行检测和荧光基团的信号放大作用，它能克服传统PCR的定量不精确，分辨率低的缺点。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于，针对现有技术存在的问题，提供结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或制剂中的新的用途。所述结核分枝杆菌Rv0324基因作为针对结核分枝杆菌细胞的作用靶标应用于制备治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或制剂。
[0007]本发明所述的治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或者制剂中，含有结核分枝杆菌Rv0324基因的疫苗；所述针对潜伏结核分枝杆菌细胞的作用靶标为疫苗作用靶标。
[0008]本发明通过结核分枝杆菌Rv0324基因与结核分枝杆菌的潜伏状态之间的相关性，并结合改良后的实时定量PCR技术，提供一种准确性高，检测速度快的结核分枝杆菌潜伏状态荧光实时定量试剂盒。
[0009]本发明的检测试剂盒包含:2X逆转录反应液，20 X逆转录酶，DEPC-H20，2XPCR反应液，20X检测用引物、荧光探针，标准品；
[0010]其中2X逆转录反应液含有逆转录缓冲液、焦碳酸乙二酯处理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制剂；
[0011]其中2 XPCR 反应含有 PCR 缓冲液，MgCl2, dNTPs, Taq 酶；
[0012]检测用引物:
[0013]Rv0324 上游引物序列:5，ATA TCC CGG GCG CCA TCA A 3’
[0014]Rv0324 下游引物序列:5' CAA TGT CGC GGT CGC CAG TTA 3’
[0015]荧光探针:
[0016]Rv0324 荧光探针:5 1 -FAM-GCC GAC CGG CTC GCC GAA C-TAMRA-3 1
[0017]所述的2 X逆转录反应液，2 X PCR反应液，DEPC-H20保存于4°C，20X逆转录酶，20X检测用引物、荧光探针保存于_20°C ；
[0018]标准品为结核分枝杆菌H37Rv菌株的cDNA。
[0019]本发明的进一个目的是提供通过检测结核分枝杆菌Rv0324基因的表达量来检测潜伏状态的结核分枝杆菌的方法。
[0020]本发明中使用检测试剂盒检测结核分枝杆菌Rv0324基因的表达量:
[0021]每次检测设立阳性和阴性对照；标准品做阳性对照，或采用制备的结核分枝杆菌DNA样本，阴性对照采用DEPC-H20 ；
[0022]逆转录:总体积20 μ 1，其中2 μ I待测RNA，10 μ I 2Χ逆转录反应液，I μ I 20X逆转录酶，7 μ I DEPC-H20。25°C 10 分钟，37°C 120 分钟；
[0023]扩增:在荧光定量PCR以上进行，总体积为10μ 1，其中2μ I检测样品，5μ I2XPCR反应液，0.5μ I 20Χ检测用引物、荧光探针，2.5μ I DEPC-H20 ；
[0024]反应条件:95°C 10分钟变性，95°C 15秒、60°C I分钟进行40个循环。
[0025]本发明建立的利用Taqman技术检测Rv0324表达的方法，经检测患者表明该方法切实可行；由于采用了 PCR扩增技术，使得Rv0324表达的检测敏感性明显提高，可以在极少的标本中获得足够的信息，而且由于荧光探针的应用使得特异性也明显提高，降低了常规PCR扩增的假阳性率。本方法中所设计的引物、探针以及检测结果能为荧光定量PCR检测试剂盒的开发提供可靠的依据。
[0026]本发明的另一个目的是提供构建有结核分枝杆菌Rv0324基因的pMV361载体，该载体为一种疫苗的载体，能进入治疗潜伏状态的结核分枝杆菌。
[0027]本发明的另一个目的是提供治疗潜伏状态的结核分枝杆菌的一种含有构建有结核分枝杆菌Rv0324基因的pMV361重组质粒；其中，将带有结核分枝杆菌Rv0324基因的PMV361重组质粒转入BCG中构建的重组卡介苗。
[0028]本发明的另一个目的是提供治疗潜伏状态的结核分枝杆菌的一种重组亚单位疫苗，其中含有结核分枝杆菌Rv0324基因的pcDNA3.1+重组质粒。
[0029]本发明中，采用了目前特异性最高的的荧光探针杂交定量PCR检测技术，在保持高敏感性的前提下能减少假阳性干扰；克服了现有技术存在的如，无法精确定量，以及操作的不稳定因素会给结果分析带来影响等的缺陷，做到对PCR模板的精确定量，不仅保持了常规PCR的高灵敏性，而且由于特异性荧光探针杂交技术的应用，使得被检测基因的特异性显著提高。
[0030]本发明结合附图和具体实施例做进一步说明。应理解，实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
【附图说明】
[0031]图1显示以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒PMV261中。
[0032]图2显示高表达质粒pMV261_Rv0324在厌氧与正常情况下对H37Rv生长状况的影响。
[0033]图3显示以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒pMV361中。
[0034]图4显示以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入真核表达质粒载体pcDNA3.1+中。
[0035]图5显示以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入真核表达质粒载体中。
【具体实施方式】
[0036]实施例1:在厌氧以及正常情况下高表达结核分枝杆菌Rv0324基因能够抑制结核分枝杆菌的生长
[0037]一、构建结核分枝杆菌Rv0324基因高表达质粒
[0038]以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒PMV261中(如图1所示)，转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，转化液涂布在含有0.05mg/ml的卡那霉素的固体LB培养基平板上，37°C倒置培养，筛选阳性克隆，挑取单克隆菌落，接种至3ml含卡那霉素的液体LB培养基，37°C震荡过夜，菌液抽提质粒进彳丁测序，测序正确的质粒即为构建好的Rv0324基因闻表达质粒pMV261-Rv0324 ；
[0039]二、高表达质粒pMV261_Rv0324在厌氧与正常情况下对H37Rv生长状况的影响
[0040]将抽提出的质粒电转进入H37Rv中，分别在低氧与正常的情况下培养，低氧模型采取的是wayne模型，渐次低氧，能够真实的模拟肉芽肿微环境，同时每天检测菌浓度OD值的变化，并绘制成生长曲线(如图2所示)，无论是有氧培养还是厌氧模型下培养的H37Rv，高表达的Rv0324基因的质粒对菌株的生长都有非常明显的抑制作用。
[0041]实施例2:以结核分枝杆菌Rv0324基因构建的重组卡介苗
[0042]一、重组卡介苗的构建
[0043]以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入大肠杆菌一结核分枝杆菌穿梭质粒PMV361中(如图3所示)，卡介苗复苏后，接种至400ml 7H9(添加10% ADC和甘油)培养基中培养10-14天，在对数生长期，加入20%甘氨酸10ml至终浓度4%，继续培养24h，玻璃珠打碎菌膜，用10%甘油洗涤制备卡介苗感受态细胞，感受态细胞转入电穿孔杯中，在2.5kv/cm,25yF, 1000欧姆下进行电转化，转化液加入15ml 7H9(添加10%々0(:、甘油和了￥661180)培养基，37°C培养过夜，离心后取菌液125 μ I分别涂布于含卡那霉素的7Η10平板上，37°C静置培养；筛选阳性克隆，继续培养该阳性克隆，提取细菌裂解产物，用Rv0324抗血清Western blot分析Rv0324表达；
[0044]二、重组卡介苗免疫性分析
[0045]将上述菌苗注射C57BL/C小鼠，同时设置卡介苗(BCG)和PBS组做为对照，免疫6周后取血ELISA法检测血清抗体表达水平，无菌分离脾脏，应用ELISP0T技术检测脾细胞受到Rv0324蛋白刺激后细胞因子的表达，它们分别反映了疫苗免疫后体液免疫和细胞免疫的水平；
[0046]三、重组卡介苗动物免疫保护性分析
[0047]将上述菌苗免疫BalB/c小鼠，同时设置卡介苗(BCG)和PBS组做为对照，接种8周后，用M.tb H37Rv株攻毒，计数不同时间点小鼠体内活菌载量，比较小鼠存活曲线；
[0048]四、重组卡介苗安全性评价分析
[0049]将上述菌苗免疫SCID小鼠，同时设置卡介苗(BCG)和PBS组做为对照，计数不同时间点小鼠体内活菌载量，比较小鼠存活曲线。
[0050]实施例3:以结核分枝杆菌Rv0324基因构建的重组亚单位疫苗
[0051]一、重组质粒的构建
[0052]以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增Rv0324基因并将其克隆构建入真核表达质粒载体PCDNA3.1+中(如图4所示)，测序鉴定，制备E.col iDH5 α感受态细胞，鉴定正确的pcDNA-Rv0324基因重组质粒转化入感受态细胞，在LB培养基，37°C培养过夜，重组质粒的大量抽提采用Qiagan公司去内毒素的质粒大量抽提试剂盒；
[0053]二、重组亚单位疫苗免疫保护性分析
[0054]将上述亚单位疫苗免疫BalB/c小鼠，每两周免疫一次，共免疫3次，同时设置PBS组做为对照，最后一次免疫4周后，M.tb H37Rv株攻毒。计数不同时间点小鼠体内活菌载量，比较小鼠存活曲线。
【主权项】
1.结核分枝杆菌Rv0324基因在制备治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或制剂中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述结核分枝杆菌Rv0324基因作为针对结核分枝杆菌细胞的作用靶标用于制备治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或制剂。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述针对潜伏结核分枝杆菌细胞的作用靶标为疫苗作用靶标。4.如权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的治疗或诊断潜伏结核分枝杆菌的药物或者制剂中，含有结核分枝杆菌Rv0324基因的疫苗。5.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测潜伏状态结核分枝杆菌中Rv0324基因的试剂盒，含有2 X逆转录反应液，20 X逆转录酶，焦碳酸乙二酯处理的水，2 X聚合酶链反应液，20X检测用引物、荧光探针，标准品，其特征是:所述的2X逆转录反应液含有逆转录缓冲液、焦碳酸乙二酯处理的水、寡聚(dT)、dNTPs、RNA酶抑制剂；所述的2X聚合酶链反应液含有聚合酶链缓冲液、耐热DNA聚合酶，MgCl2, dNTPs。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是:所述的20X检测用引物、荧光探针，含有Rv0324上游引物、下游引物、荧光探针，其中: Rv0324 上游引物序列:5?ΤΑ TCC CGG GCG CCA TCA A 3’ Rv0324 下游引物序列:5' CAA TGT CGC GGT CGC CAG TTA 3’ Rv0324 荧光探针:5 1 -FAM-GCC GAC CGG CTC GCC GAA C-TAMRA-3 1。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是:所述的标准品是潜伏状态结核分枝杆菌H37Rv 的 cDNA。8.一种结核分枝杆菌Rv0324基因构建的重组卡介苗，其特征在于，其中含有构建有结核分枝杆菌Rv0324基因的pMV361重组质粒。9.如权利要求8中所述结核分枝杆菌Rv0324基因的重组卡介苗，其特征在于将带有结核分枝杆菌Rv0324基因的pMV361重组质粒转入BCG中构建的重组卡介苗。10.一种结核分枝杆菌RV0324基因构建的重组亚单位疫苗，其特征在于，其中含有结核分枝杆菌Rv0324基因的pcDNA3.1+重组质粒。
【文档编号】A61K48/00GK105861636SQ201510026294
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月19日
【发明人】孙娴, 李瑶, 姜君, 吴海, 张鹭, 杨秀方
【申请人】复旦大学