用于快速检测食用向日葵杂交种sh338真实性的试剂盒的制作方法

用于快速检测食用向日葵杂交种sh338真实性的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述试剂盒包括各自独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，所述引物液部分含有如下引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的至少一种。所述试剂盒可以在短时间内对大量待测向日葵检测，且检测结果准确，稳定可靠。
【专利说明】
用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于鉴定农作物种子真实性和品种纯度领域，具体设及一种基于SSR分子 标记技术建立的可快速检测向日葵杂交种S册38真实性的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 向日葵化elianthus annuus L.)为菊科（Composicae)向日葵属的双子叶植物。 向日葵分为油用型、食用型和兼用型向日葵，染色体基数均为17,有二倍、四倍、六倍不同 倍数水平，其中栽培种为二倍体，属虫媒异花授粉作物，野生种在二倍、四倍、六倍等不同倍 数水平均有发现。自上世纪60年代W来，向日葵在世界各地得到迅速发展，其油脂产量仅 次于大豆。向日葵属喜光性短日植物，全生育期有效积溫> 1800-2600°C ;耐旱耐盐碱，耐 瘡薄，对±壤有极广的适应性，最适宜的±壤为壤±和沙壤±。因此，在我国北方干旱、降 雨少、±壤盐碱化严重的地区，向日葵成为当地农民脱贫致富、增产增收的经济作物。然而 优良杂交种的推广应用需要大量优质种子，杂交种的真实性和纯度的高低直接影响着杂交 向日葵的产量和农民种植的积极性。为保护新品种和农民的利益，降低因假种子和纯度低 而导致的损失，迫切需要进行向日葵杂交种真实性和纯度的检验工作，并建立一种准确、简 单、快捷的杂交种真实性和纯度鉴定方法。
[0003] 传统的向日葵杂交种的真实性与品种纯度鉴定采用形态学鉴定法。形态学鉴定法 是依靠种子或植株的表型性状来鉴别不同的个体，该方法比较直观、简便，但由于可直接观 测的农艺性状十分有限，有些性状要在特定的生育期才能检测，有些性状易受环境条件的 影响，从而受到很大限制，且形态鉴定法工作量大、鉴定周期长、成本高、受季节限制。关键 是如果混杂的材料在表型上与被鉴定杂交种的性状完全一致，采用运种方法就无法鉴定出 伪杂种。
[0004] 随着分子生物学技术的发展，分子标记技术越来越多的应用于农作物种子的真实 性与品种纯度鉴定。分子标记鉴定技术是W DNA分子多态性为基础的一种遗传标记，能稳 定遗传，可W反映生物的个体和群体特征。由于分子标记可W直接反映 DNA水平上的差 异，具有高度的专一性和特异性，用于鉴定种子纯度的分子标记主要的方法有RAPD、SSR和 SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)标记技术具有数量丰富、多态性高、共显性遗 传、扩增稳定、易于检测等方面的优点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性、 标记和定位基因 W及分子标记辅助方面的应用。SSR标记通常具有共显性的特点，Fi杂交 种具有双亲等位基因的互补带型。鉴于不育系和其同型保持系遗传背景基本一致，只在不 育基因、保持基因等特征基因上存在差异，据此特征基因选择DNA分子标记进行分析，从而 实现有效地区别和鉴定。SSR标记已成为现阶段用于鉴定种子纯度的常用方法，已广泛应 用于玉米、水稻、大豆的新品种纯度鉴定。但是目前在食用向日葵杂交种使用SSR分子标记 技术鉴定其真实性和纯度的报道鲜有，建立一套适于食用向日葵杂交种真实性和纯度鉴定 的SSR分子标记技术具有重要意义，可W克服传统的田间小区种植鉴定所带来的不足。 阳0化]SH338是北京=瑞农业科技有限公司2014年选育的食用向日葵中熟杂交种，其亲 本组合为A03-6 X 06R-2,生育期105天左右，长势旺，植株整齐度好；幼苗绿色，幼茎绿带紫 色；叶片呈屯、脏形，叶脉明显，叶片较大，植株呈塔形，舌状花和管状花为黄色，花药为紫色； 株高223厘米，花盘直径20. 3厘米，巧粒排列紧密度中等，群体生长整齐度中等，平均不育 株率〇%，平均分枝株率0.3% ;百粒重17. 5克，巧仁率51. 1%，结实率73. 5%，单盘粒重 106. 9克4子粒长度2. 27厘米，宽0. 84厘米4子粒长卵形，颜色为褐底白边稍有白纹4子粒 排列紧密中等，花盘倾斜度4-5级，盘面形状平；盘腐型菌核病、褐斑病、黑斑病0-2级，根 茎腐型菌核病、诱病、霜霉病0-1级，黄萎病0-3级，茎腐病株率0. 2%，平均倒伏（含倒折） 率3. 4%，平均折茎率1. 6 %。抗性强，耐盐碱，产量高而稳定，较大面积生产的同类品种增 产9. 1%-13.3%，商品性好。为保证该优质品种的最大经济效益及其产业化的发展，需要 一种权威的、高效准确的检测方法来鉴定所述食用向日葵杂交种甜338的真实性和品种纯 度，加快杂交种的质量检测进程。

【发明内容】

[0006] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种可快速鉴定食用向日葵杂交种 SH338真实性的试剂盒，所述试剂盒使用方便、快捷，能够在短时间内对大量的待测食用向 日葵杂交种S册38样品进行快速鉴定，测定结果准确稳定可靠。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种用于快速检测食用向日葵杂交种S册38 真实性的试剂盒，所述试剂盒包括各自独立包装的引物液、PCR反应液和DNA聚合酶部分， 其中，所述引物液部分含有如下SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一种：
[0008] SR-123-F: 5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0009] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,；
[0010] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0011] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 > ;
[0012] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0013] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3，。
[0014] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述引物液部分 中的引物为引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的任意两种。
[0015] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，所述PCR反应液 部分含有用于进行PCR扩增的含Mg 2+扩增缓冲液、dNTPs W及d地2〇。
[0016] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的试剂盒，所述DNA聚合酶 为化q DNA聚合酶。
[0017] 所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，每支所述试剂盒 的配方为： 阳0化]引物液，0. 2yM，1化；
[0019] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ;
[0020] 10 X 含 Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ;
[0021] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0022] (1地2〇，17化。
[0023] 本发明提供了一种利用所述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的 方法，包括如下步骤，
[0024] (1)分别取由待测食用向日葵杂交种甜338、W及标准向日葵种子A03-6和06R-2 种植得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA ;
[00对 似取步骤（1)获得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的试剂盒分 别对各所述基因组DNA进行PCR扩增；
[00%] (3)分别将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行凝胶电泳处理，获得所述待测 食用向日葵杂交种甜338 W及其亲本标准向日葵A03-6和06R-2的电泳图谱；
[0027] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所 述杂交种S册38同时具有其亲本标准种子A03-6和06R-2的特征谱带，则判定所述待测食 用向日葵杂交种甜338为真实；反之，为假。
[0028] 所述的快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，所述DNA模板的加入量 为30ng配制1 Ji L。
[0029] 所述的快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，所述步骤似中，PCR扩 增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每个循环退 火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s，进行30个循环， 最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C或-20°C保存，备用。
[0030] 本发明提供了一种所述的试剂盒在鉴定优质食用向日葵杂交种甜338真实性领 域中的用途。
[0031] 本发明提供了一种所述的快速检测优质食用向日葵杂交种甜338的方法在鉴定 食用向日葵杂交种甜338真实性领域中的用途。
[0032] 本发明的上述技术方案相比现有技术具有W下优点：
[0033] (1)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，通过 大量引物筛选研究，筛选出了引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114，使用上述引物中的 至少一种对待测食用向日葵杂交种SH338进行品种的鉴定，电泳图谱清晰，在短时间内进 行大量的食用向日葵杂交种S册38的品种鉴定，鉴定结果稳定、准确可靠；
[0034] (2)本发明所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，操作 步骤简单、易操作，可W高效的对食用向日葵杂交种SH338的品种鉴定，检测结果准确。
【附图说明】
[0035] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0036] 图1是本发明实施例1的食用向日葵杂交种甜338的电泳图谱；
[0037] 图2是本发明实施例2的食用向日葵杂交种甜338的电泳图谱；
[0038] 图3是本发明实施例3的食用向日葵杂交种甜338的电泳图谱。
【具体实施方式】
[0039] 本发明所使用的主要试剂如下：
[0040] RNase A生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为GElOl ;
[0041] GelSafe核酸染料生产厂家为北京原平瞧生物技术有限公司，型号为EP106-01 ;
[0042] 所使用的SSR引物生产厂家为生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0043] Eas^ap Buffer化r PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为 APl12-02 ；
[0044] dNTPs生产厂家为北京全式金生物技术有限公司，型号为APl 12-02 ;
[0045] ￡日3升耶DNA Polymerase化r PAGE生产厂家为北京全式金生物技术有限公司、型 号为 AP112-02 ;
[0046] TEMED生产厂家为SIGMA，型号为T8133 ;
[0047] 本发明所使用的主要设备如下：
[0048] 高速冷冻离屯、机生产厂家为SIGMA、型号为3K15 ;
[0049] 电泳仪生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYY-8C ;
[0050] 水平电泳槽生产厂家为北京市六一仪器厂，型号为DYCP-31E ;
[0051] 凝胶成像系统生产厂家为北京赛智创业科技有限公司，型号为化ampGel5000。 阳0巧实施例1
[0053] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
[0054] 所述引物液部分中的引物为引物SR-123,所述SR-123引物为： 阳化5] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 阳化6] SR-123-R: 5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,。
[0057] 每支所述试剂盒的配方为： 阳0郎]引物液，0. 1化；
[0059] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; W60] 10 X 含 Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ;
[0061] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0062] (1地2〇，17化。
[0063] 利用上述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，包括如下步 骤： W64] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种甜338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下， W65] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0066] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次；
[0067] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清600 y L至离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构 成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL离屯、管中，备用； W側 d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧111离屯、10111111，吸取上清300 ^1至1.5血离屯、管中，备用；
[0069] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳070] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0071] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0072] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0073] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中， 180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥 散，则表明DNA已降解不可用；
[0074] 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增： 阳0巧]PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0076] 做分别将步骤似获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到 所述食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述 凝胶电泳包括如下步骤：
[0077] 所述凝胶电泳体系包括：
[0078] 尿素（Urea)，420g ; 阳0 巧]5 X TBE ,IOOmL;
[0080] 丙締酷胺，57g 阳0川 N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ;
[0082] (1地2〇 定容至 IL ;
[0083] A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和d地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热； W84] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOiiL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳0财 （4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图 1所示，M为分子量标准，Pi A为食用向日葵杂交种甜338的亲本标准向日葵种子A03-6和 06R-2, Fi为食用向日葵杂交种甜338,从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种甜338 同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。
[0086] 实施例2
[0087] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
[0088] 所述引物液部分中的引物为引物SR-889,所述SR-889引物：
[0089] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0090] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 >。
[0091] 每支所述试剂盒的配方为： 阳〇9引 引物液，0. 1化；
[0093] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ;
[0094] 10 X 含 Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ;
[00巧]dNTPs, 2. 5mM, 2 Ji L ;
[0096] (1地2〇，17化。
[0097] 利用上述试剂盒快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，包括如下步 骤：
[0098] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种甜338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
[0099] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨株珠值=0. 6mm不诱钢 珠）的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条 件下研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用； 阳100] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳W] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清750 y L至离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构 成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL离屯、管中，备用； 阳102] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清400 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用；
[0103] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0104] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得； 阳1化]将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0106] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0107] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积eXLoading Buffer混 合，并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔 中，180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型 弥散，则表明DNA已降解不可用；
[0108] 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增： 阳109] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物-20°C保存，备用； [0110] (3)将步骤（2)获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到所述 食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶 电泳包括如下步骤： 阳111 ] 所述凝胶电泳体系包括：
[0112]尿素 OJrea)，420g ; 阳11引 5 X T邸，100血；
[0114] 丙締酷胺，57g
[0115] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ; 阳116] (1地2〇，比；
[0117] A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和d地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热； 阳118] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOiiL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。
[0119] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图 2所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜338的亲本标准向日葵种子A03-6和 06R-2, Fi为食用向日葵杂交种甜338,从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种甜338 同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。 阳120] 实施例3 阳121] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
[0122] 所述引物液部分中的引物为引物SR-1114,所述SR-1114引物：
[0123] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0124] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3'。 阳1巧]每支所述试剂盒的配方为： 阳126] 引物液，0. 2yM，1化； 阳 127] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 阳12引 10 X含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ; 阳 129] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 阳 130] ddH2〇, ITiiLo 阳131] 利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，包括如下步 骤：
[0132] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种甜338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下， 阳13引 a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用； 阳134] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳13引 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清800 y L至离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构 成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清600 y L至 2mL离屯、管中，备用；
[0136] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清350 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用；
[0137] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀；
[0138] f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0139] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0140] 所述定量检测步骤具体包括：取DM样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用； 阳141] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中， 180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥 散，则表明DNA已降解不可用； 阳1创 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增， 阳143] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0144] (3)将步骤（2)获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到所述 食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶 电泳包括如下步骤：
[0145] 所述凝胶电泳体系包括：
[0146] 尿素 OJrea)，420g ; 阳 147] 5 X T邸，100血；
[0148] 丙締酷胺，57g 阳149] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ; 阳150] (1地2〇定容至IL ; 阳151] A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和d地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热； 阳152] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOiiL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳153] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，如图 3所示，M为分子量标准，Pi、Pz为食用向日葵杂交种甜338的亲本标准向日葵种子A03-6和 06R-2, Fi为食用向日葵杂交种甜338,从图中可W看到所述待测食用向日葵杂交种甜338 同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种SH338为真实的。 阳154] 实施例4
[0K5] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中， 阳156] 所述引物液部分中的引物为引物SR-889和引物SR-1114,所述SR-889引物：
[0157] SR-889-F: 5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0158] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 > ; 阳159] 所述SR-1114引物：
[0160] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0161] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3'。
[0162] 每支所述试剂盒的配方为： 阳16引 引物液，0.2 yM，Iii L ;
[0164] Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 阳1化]10 X含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ; 阳 166] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 阳 167] ddH2〇, 17 yLo
[0168] 利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，包括如下步 骤： 阳1例 （1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种SH338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下， 阳170] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用； 阳171] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳17引 C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于1200化pm下离屯、IOmin后，吸 取上清600 y L至离屯、管中，并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构 成的混合液，震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL离屯、管中，备用；
[0173] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血离屯、管中，备用；
[0174] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳1巧]f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0176] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0177] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围I. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0178] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中， 180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥 散，则表明DNA已降解不可用；
[0179] 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增， 阳180] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物-20°C保存，备用； 阳181] (3)将步骤（2)获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到所述 食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶 电泳包括如下步骤： 阳182] 所述凝胶电泳体系包括：
[0183]尿素 OJrea)，420g ; 阳化4] 5 XTBE, IOOmL ； 阳化日]丙締酷胺，57g 阳186] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g; 阳187] (1地2〇定容至1L;
[0188] A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热；
[0189] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOyL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。
[0190] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所 述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种 SH338为真实的。
[0191] 实施例5 阳192] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中， 阳193] 所述引物液部分中的引物为引物SR-123和SR-889,所述SR-123引物：
[0194] SR-123-F: 5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 阳 1 巧]SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3'; 阳196] 所述SR-889引物包括：
[0197] SR-889-F: 5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0198] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 >。
[0199] 每支所述试剂盒的配方为： 阳2〇0] 引物液，0. 2yM，1化； 阳 2〇U Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 阳20引 10 X含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ; 阳20引 dNTPs，2. 5mM，2yL ; 阳204] ddH2〇, 17 yLo 阳205] 利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种S册38真实性的方法，包括如下步 骤： 阳206] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种甜338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
[0207] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用；
[0208] b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳209] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清650 y L并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构成的混合液， 震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清500 Ji L至2血离屯、管 中，备用；
[0210] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清400 yL至1. 5血离屯、管中，备用； 阳211] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳21引 f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得；
[0213] 将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测：
[0214] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用；
[0215] 所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中， 180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥 散，则表明DNA已降解不可用；
[0216] 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增， 阳217] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C保存，备用；
[0218] (3)将步骤（2)获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到所述 食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶 电泳包括如下步骤：
[0219] 所述凝胶电泳体系包括： 阳220]尿素（Urea)，420g ; 阳 22U 5 X T邸，100血； 阳222] 丙締酷胺，57g 阳扣引 N、N' -亚甲基双丙締酷胺，3g; 阳224] (1地2〇定容至IL ; 阳225] A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和(1地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热；
[0226] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入10化的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳227] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所 述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种 SH338为真实的。 阳22引 实施例6
[0229] 本实施例所述用于快速检测食用向日葵杂交种甜338真实性的试剂盒，包括各自 独立包装的引物液、反应液和DNA聚合酶部分，其中，
[0230] 所述引物液部分中的引物为引物SR-123、SR-889和SR-1114,所述SR-123引物： 阳231 ] SR-123-F: 5 ' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 阳232] SR-123-R:5,-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,； 阳23引 所述SR-889引物：
[0234] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，； 阳235] SR-889-R:5'-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3' ； 阳236] 所述SR-114引物：
[0237] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ; 阳2；38] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3，。 阳239] 每支所述试剂盒的配方为： 阳24〇] 引物液，0. 2yM，1化； 阳241] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 阳2创 10 X含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2. 5 y L ;
[0243] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0244] (1地2〇，17化。
[0245] 本实施例利用所述试剂盒快速鉴定食用向日葵杂交种甜338真实性的方法，包括 如下步骤： 阳246] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵杂交种甜338及其亲本标准向日葵种 子A03-6和06R-2种植得到的向日葵的基因组DNA，所述步骤具体如下，
[0247] a)取所述食用向日葵真叶IOmg (约Icm2)置于装有研磨珠值=0. 6mm不诱钢珠） 的2mL离屯、管中，置于液氮中预冷冻，并将预冷冻过的离屯、管置于研磨器中在30化条件下 研磨30s，随后迅速转移所述离屯、管于液氮中待用； 阳24引 b)取出步骤a)的离屯、管并加入1000 y L预热过的由体积比为20:1的CTAB缓冲 液和琉基乙醇构成的混合液，震荡混匀，然后65°C下水浴反应50min，每IOmin取出所述离 屯、管上下颠倒混匀一次； 阳249] C)将步骤b)反应后的离屯、管放入4°C离屯、机中，于12000巧m下离屯、IOmin后，吸 取上清800 y L并加入等体积的由体积比为1:1的=氯甲烧和Tris饱和酪构成的混合液， 震荡混匀，放入4°C离屯、机中，于1200化pm离屯、15min后，吸取上清600 y L至2血离屯、管 中，备用； 阳巧0] d)向步骤C)中的所述离屯、管中加入等体积S氯甲烧混匀，静置3min后，放入4°C 离屯、机，12000巧m离屯、lOmin，吸取上清300 Ji L至1. 5血离屯、管中，备用； 阳巧1] e)向步骤d)中的所述离屯、管中加入等体积异丙醇，震荡混匀并静置3min，放入 4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液，并向剩余沉淀中加入1血质量浓度为75%的乙 醇，摇晃离屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C离屯、机，750化pm离屯、7min，弃去上清液， 惊干沉淀； 阳巧引 f)向步骤e)中弃去上清液后的沉淀中加入30 y L的无菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C条件下保存溶液，即得； 阳巧引将上述步骤f)提取得到的基因组DNA进行定量检测和/或质量检测： 阳巧4] 所述定量检测步骤具体包括：取DNA样品2 y L用d地2〇稀释400倍，用紫外分光 光度仪测定〇〇2日。、〇〇28。，并计算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范围1. 7-1. 9内，则DNA纯 且可用；若超出上述比值范围，则DNA含杂质多不可用； 阳巧日]所述质量检测步骤具体包括：取5 Ji L样品DNA与等体积6 X Loadin浊Uffer混合， 并加入到含有体积比为万分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%琼脂糖凝胶上样孔中， 180V电泳30min，凝胶成像，若电泳条带呈一致密亮，则DNA纯且可用；若无带出现，带型弥 散，则表明DNA已降解不可用；
[0256] 似取步骤（1)的基因组DNA为模板，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 y L， 利用所述的试剂盒分别对各所述基因组DNA进行PCR扩增， 阳巧7] PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每个循环退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物4°C保存，备用； 阳巧引 （3)将步骤（2)获得的PCR扩增产物进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，得到所述 食用向日葵杂交种S册38及其亲本标准向日葵种子A03-6和06R-2的电泳图谱，所述凝胶 电泳包括如下步骤： 阳巧9] 所述凝胶电泳体系包括：
[0260]尿素（Urea)，420g ; 阳 26U 5 X T邸，100血； 阳％2] 丙締酷胺，57g 阳％3] N、N'-亚甲基双丙締酷胺，3g ;
[0264] (1地2〇 定容至 IL ;
[02化]A)配制6%变性聚丙締酷胺凝胶，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝胶电泳体系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亚甲基双丙締酷胺和d地2〇混合均匀制成胶混合液，待充 分溶解后，采用双层滤纸过滤，室溫保存，备用；向上述制备的胶混合液中加入适量质量浓 度为10 %的APS (催化剂）和TEMED (加速剂）（取胶混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，摇匀，灌胶，缓慢插入与胶厚度一致的梳子，同时避免梳齿下产生气泡，待胶凝固 后，拔去梳子（注意不要将梳齿拔断），并用水稍微冲洗点样孔处，玻璃板放入电泳槽，固定 在电泳槽上，电泳槽中加入适量1 X TBE电泳缓冲液，在电压300V，电流约50mA-60mA条件下 预电泳比，使凝胶预热；
[0266] B)取步骤似获得的PCR扩增产物加入IOiiL的IX上样缓冲液（二甲苯菁 0.025g，漠酪蓝0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去离子甲酯胺98ml)中混合均匀，95°C 变性5min，4°C冷却，每上样孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定电压300V，电流50mA-60mA下电 泳比，当漠酪蓝移动到距离胶板下沿约Icm时，停止电泳，取出胶板，用d地2〇冲洗干净后， 经3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，将所述凝胶置于凝胶成像仪下，在波长为302nm紫外光 激发下并拍照。 阳％7] (4)对比上述杂交种甜338 W及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所 述待测食用向日葵杂交种SH338同时具有其双亲特征谱带，则所述待测食用向日葵杂交种 SH338为真实的。
[0268] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其特征在于，包括各 自独立包装的DNA聚合酶部分、PCR反应液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有如下 SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一种； SR-123-F:5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3' ； SR-123-R:5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3' ； SR-889-F:5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3' ； SR-889-R:5' -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3' ； SR-1114-F:5 ' -AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3 ' ； SR-1114-R:5 ' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3 '。2. 根据权利要求1所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂盒，其 特征在于，所述引物液部分中的引物为SR-123、SR-889和SR-1114引物中的任意两种。3. 根据权利要求1或2所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂 盒，其特征在于，所述PCR反应液部分含有用于进行PCR扩增的含Mg 2+扩增缓冲液、dNTPs 以及ddH20。4. 根据权利要求1或2所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂 盒，其特征在于，所述DNA聚合酶部分含有Taq DNA聚合酶。5. 根据权利要求1-4任一所述的用于快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的试剂 盒，其特征在于，每支所述试剂盒的配方为： 引物液，〇·2μΜ，lyL; Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ; 10 X含Mg2+扩增缓冲液，2mM，2· 5 μ L ; dNTPs，2· 5mM，2 yL ; ddH20,17 μ L。6. -种快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其特征在于，包括如下步骤， (1) 分别取由待测食用向日葵杂交种SH338、以及标准向日葵种子A03-6和06R-2种植 得到的向日葵真叶为材料，利用常规CTAB法提取上述各食用向日葵的基因组DNA ; (2) 取步骤（1)获得的基因组DNA为模板，利用权利要求1-5任一所述的试剂盒分别对 各所述基因组DNA进行PCR扩增； (3) 分别将步骤（2)获得的各样本PCR扩增产物进行凝胶电泳处理，获得所述待测食用 向日葵杂交种SH338以及其亲本标准向日葵A03-6和06R-2的电泳图谱； (4) 对比上述杂交种SH338以及其亲本标准种子A03-6和06R-2的电泳图谱，若所述杂 交种SH338同时具有其亲本标准种子A03-6和06R-2的特征谱带，则判定所述待测食用向 日葵杂交种SH338为真实；反之，为假。7. 根据权利要求6所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其特征在 于，所述DNA模板的加入量为30ng配制1 μ L。8. 根据权利要求6或7所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338真实性的方法，其 特征在于，所述步骤（2)中，PCR扩增程序如下：95°C预变性3min，94°C变性30s，64°C退火 30s，72°C延伸30s，之后每个循环退火温度下降0. 5°C，直至54°C，94°C变性30s，54°C退火 30s，72°C延伸30s，进行30个循环，最终72°C延伸20min，最终降至4°C，获得的扩增产物 4°C或-20°C保存，备用。9. 一种权利要求1-5任一所述的试剂盒在快速鉴定食用向日葵杂交种SH338真实性领 域中的用途。10. -种权利要求6-8任一所述的快速检测食用向日葵杂交种SH338的方法在鉴定食 用向日葵杂交种SH338真实性领域中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK105861637SQ201510031829
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2015年1月22日
【发明人】司立平, 张永平, 马德甯, 姚梅园, 万县贞
【申请人】内蒙古三瑞农业科技有限公司, 北京三瑞农业科技有限公司, 甘肃德瑞农业科技有限公司