一种结核分枝杆菌esat-6蛋白检测试剂盒、制备方法以及使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物领域，具体涉及一种结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测试剂盒、制备 方法以及使用方法。 技术背景
[0002] 本发明建立了一种检测结核分枝杆菌相关抗原ESAT-6的纳米磁珠-近红外荧光 标记-检测试剂盒。包括单克隆抗体的近红外荧光染料标记方法和纳米磁珠的多克隆抗体 包被方法以及系列相关试剂。本发明以近红外荧光染料作为标记，采用免疫分析原理，制 备检测ESAT-6双抗体夹心法近红外荧光试剂盒。采用便携式流动进样荧光检测器进行磁 珠-结合物荧光强度测定。定量检测时，将样本检测值代入标准方程，即可分析检测样本中 靶蛋白的浓度；定性检测则以阴性对照的荧光强度的2倍作为反应体系的cutoff值，大于 2倍cutoff值为阳性，反之则为阴性。该试剂盒适用于病理样本中结核分枝杆菌相关蛋白 的检测。本发明具有快速、高敏、兼顾定性及精准定量的特点。
[0003] 结核病是一种古老的传染性疾病，目前全世界有1/3的人口受结核分枝杆菌的感 染，每年有近800万人死于肺结核；耐药性和多重耐药性菌株的大量出现，又为结核病的控 制带来更大的困难；更多的研宄还证实结核分枝杆菌能增强HIV-I病毒的复制，因此在艾 滋病感染者中，双重感染者众多，成为导致AIDS患者死亡的主要原因。我国目前的TB患者 数量居世界第二位，是世界上22个TB高负担国家之一，2000年我国第4次TB流行病学抽 样调查资料显示，我国MTB感染率为44. 5%，活动性TB患者451万，每年死亡人数达13 万。
[0004]目前对于结核分枝杆菌的检验手段主要有涂片镜检法，该方法需要检测人员具 有熟练的检验技能，方法检测灵敏度低，一般需标本中存在l*l〇3CFU/ml个细菌才有10~ 15%的阳性率，并且对细菌无法进行准确的鉴定；培养法，主要在传染病医院进行该项工 作，检测周期较长，一般需要6周时间才能发报告，晚近出现的全自动微生物鉴定仪虽然大 大缩短了检验周期，通常需要2周左右时间，这仍未根本解决效率的问题，并且存在着成本 高昂的缺陷，单纯的试剂成本在120元/测试，且需要大型的设备；血清学检验方法主要 集中在对结核分枝杆菌相关抗体的检测，由于结核感染患者存在免疫力低下的问题，往往 不表达相关抗体，或者由于成人感染结核菌几率多，由于免疫记忆，许多曾感染者也可检测 出相关抗体，这就为判断造成麻烦；分子生物学的手段近来广范运用于临床检测，诸如PCR 法、探针检测法等，这些方法特异性好，但需要特殊的检测仪器，推广运用存在问题，超高的 灵敏度也带来了难以克服的问题-假阳性；结核感染T细胞斑点试验用于检测结核感染 后特异性T细胞分泌的γ -干扰素，并据此结果判断是否感染了结核，该方法特点是繁琐， 成本高，不宜推广，目前主要在西方国家作筛查使用；结核分枝杆菌特异性噬菌体扩增试验 也曾在结核病实验室发挥过作用，也存在繁琐、成本高，在结果判断中需要足够的经验的缺 点。该方法的假阳性率为3 %~7 %，假阴性率为15 %~40 %。与培养的阳性符合率为 75%~95%，特异性为88%~99%。
[0005] 本发明将纳米磁珠法与近红外荧光标记法结合起来，利用纳米磁珠表面羧基活化 后可与抗体表面的氨基共价结合，从而将抗体固定到纳米磁珠表面，发挥了纳米磁珠比表 面积大，吸附性强，悬浮稳定性好，有利于抗原抗体反应顺利进行的特点；同时近红外荧光 染料具有灵敏度高、选择性好的优点，它的激发光以及发射光光谱均在近红外区域，可最大 限度减少环境中杂散荧光物质的干扰等优点。建立起结核分枝杆菌相关抗原ESAT-6的近 红外荧光标记-纳米磁珠检测方法，ESAT-6检测限量达0. 5ng/ml水平。
[0006] 试剂盒组成20人份
[0007] 1、A液近红外荧光染料标记ESA-6单克隆抗体Iml
[0008] 2、B液ESAT-6多克隆抗体包被磁珠 Iml
[0009] 3、PBS 缓冲液 IOml
[0010] 4、ESAT-6 标准品（1000ng/ml) 0.2ml
【发明内容】
[0011] 为了克服上述缺陷，提供以下技术方案：
[0012] 一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白检测 试剂盒，所述试剂盒由近红外焚光染料标记的单克隆抗体、多克隆抗体包被的纳米磁珠、 磁性分离器、蛋白标准品、缓冲液组成；其中，近红外荧光染料标记的单克隆抗体为鼠抗 ESAT-6 ;包被纳米磁珠的多克隆抗体为鼠多抗ESAT-6。建立ESAT-6蛋白标准品梯度浓度 和荧光发射值之间的工作曲线，将所测得的发射荧光强度，代入方程即可完成样品中目标 蛋白含量的定量（定性）检测。
[0013] 优选地，所述近红外荧光染料为激发光波长为777nm，发射光波长为790nm的荧光 分子，优选NHS活化的近红外荧光染料DyLight800。
[0014] 所述的一种基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6蛋白 检测试剂盒的制备方法，步骤如下：
[0015] (1)制备近红外荧光染料标记的ESAT-6单克隆抗体；
[0016] 将 Dylight800 (购自 Thermofisher 公司）用 PBS 缓冲液（PH7. 4)稀释 10 倍，取 1. 4 μ L与20 μ g鼠抗ESAT-6单克隆抗体（lmg/ml) (Pierece公司）轻柔混合均勾后于室温 避光反应2小时；反应结束后，将标记产物放入透析袋中，4°C，PBS缓冲液透析4小时。标 记好的抗体溶液中添加终浓度为I. 5% BSA和0. 1% TWeen20,叠氮化钠0. 1%。，4°〇保存； 使用前将标记产物以PBS稀释2500倍；
[0017] (2)制备ESAT-6多克隆抗体包被的纳米磁珠（购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公 司北京生物技术研宄所）；
[0018] 纳米磁珠的预处理；
[0019] 轻轻混勾磁珠悬浮液，吸取0.0 lml悬浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP试管中；再加 入0.1 ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤 1次；
[0020] 加入1ml 0· IM的乙磺酸溶液（pH = 5. 0, MES)，重悬磁珠；
[0021] 纳米磁珠的活化
[0022] 将上述EP管置于磁板上，用ImlMES洗涤2次，弃上清；
[0023] 临用前配置终浓度为0.1 M的MES，其内含EDC和NHS的浓度均为40g/L(加入上述 两种物质后，置于振荡器上充分混匀15分钟，待用）。用该液重悬磁珠；
[0024] 用磁板吸附磁珠，弃上清，再用MES清洗一次，吸附磁珠后，弃上清；
[0025] (3)磁珠与蛋白的链接；
[0026] 在已处理好的磁珠中加入50 μ L ESAT-6多克隆抗体（lmg/ml) (Pierece公司售） 和500 μ L PBS (PH5. 5)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育2小时；
[0027] 用PBS缓冲液（ΡΗ5. 5, (λ 05 % Tween)清洗3次，弃上清；
[0028] 加入1ml Tris缓冲液（0. 1M，0. 1 % BSA)，混匀，室温，置于摇床上持续震荡，孵育 2小时；
[0029] 加入1ml PBS缓冲液（PH5. 5,0· 05% Tween)，静置2分钟，弃上清；重复3次，加入 Iml PBS缓冲液（PH5. 5)，弃上清，重复3次。弃上清时，试管需置于磁板上；
[0030] 加入 Iml PBS 缓冲液（pH = 7. 4,0· 05% Tween-20,0. 1% BSA，0. 05NaN3)，待用；
[0031 ] (4)制备ESAT-6系列标准品；
[0032] ESAT-6(全片段重组蛋白，lmg/ml)(购自杭州启泰生物公司），PBS(PH7. 4)缓冲液 稀释至 l、5、50、250、1000ng/ml。
[0033] 一种使用所述的基于纳米免疫磁珠-近红外荧光标记法的结核分枝杆菌ESAT-6 蛋白检测试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
[0034] (1)各取50 μ L各浓度的ESAT-6于EP管中，另取1支EP管加入50 μ LPBS (PH7. 4) 缓冲液作为阴性对照；
[0035] (2)以上各管加入荧光标记的ESAT-6单抗50 μ L，37°C反应30分钟；
[0036] (3)取完成预处理纳米免疫磁珠100 μ L，用PBS缓冲液（PH7. 4)稀释至1000 μ L ; 吸取50 μ L免疫磁珠，，加入所述试管中，37 °C反应15分钟，磁板上静置2分钟，弃上清；加 入500 μ LddH2O,磁板上静置2分钟，弃上清，重复该步骤3次；
[0037] 所述预处理纳米免疫磁珠的处理方法为：
[0038] 制备ESAT-6多克隆抗体包被的纳米磁珠（购自武汉哇哇噻纳技术开发有限公司 北京生物技术研宄所）；
[0039] 1)纳米磁珠的预处理：
[0040] 轻轻混勾磁珠悬浮液，吸取0.0 lml悬浮液（25mg/ml)加入I. 5ml EP试管中；再加 入0.1 ml重蒸水，轻轻混匀并将试管架置磁板上，静置2分钟后吸取上清液；重复上述步骤 1次；
[0041] 加入1ml 0· IM的乙磺酸溶液（pH