核酸适体-汞离子复合物的解离及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及汞离子的检测方法。更具体来说，涉及利用核酸适体来检测汞离子的方法。
【背景技术】
[0002]汞离子作为一种重金属离子，具有较强毒性，可在生物体内累积，摄入量较大时会对免疫系统和神经系统造成严重危害。因此，对汞离子污染的研宄受到了广泛关注，并发展了丰富多样的检测方法，包括原子吸收光谱法、荧光法、电化学法、生物传感检测法等。其中，生物传感检测技术由于其优秀的特异性分子识别能力，在快速检测小分子方面展现了良好的能力。尤其是核酸适体技术，经过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)筛选出的核酸适体与靶物质之间的亲合力甚至强于DNA互补碱基对之间的结合力，因而经常被用于基因突变、可卡因、重金属汞离子、铅离子等小分子的快速检测。
[0003]在当前的核酸适体检测汞离子研宄中，核酸适体作为识别探针捕捉汞离子，并结合荧光基团、电化学等手段实现汞离子的快速定量检测。然而，目前核酸适体的使用都是一次性的，无法进行重复利用，导致核酸适体的使用效率低下、使用成本较高。因此，研宄核酸适体-汞离子复合物的解离方法非常必要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种利用核酸适体来检测汞离子的方法，其中的核酸适体能够被重复使用。
[0005]根据本发明的第一方面，提供了一种核酸适体-汞离子复合物的解离方法，包括:
[0006]用盐酸调节双蒸水使其pH为4-7并加热至25°C -55°C以形成解离溶液；以及
[0007]将附着有核酸适体-汞离子复合物的玻片载体置于解离溶液中并以25-50次/min的频率震荡30_100min，从而将未尚子与玻片载体上附着的核酸适体充分解尚。
[0008]在本发明的一个优选实施例中，解离温度为55°C而解离震荡频率为50次/min。因为发明人发现，在上述解离过程中，解离温度在15°C _75°C之间时，与汞离子的解析效率成线性正比例关系；但如果解离温度超过55°C，则解离汞离子后的固定化核酸适体的重复使用次数会大大减少。另外，解离震荡频率在25-100次/min之间时，震荡频率越快，汞离子的解析效率越高；但如果震荡频率超过50次/min时，解离汞离子后的固定化核酸适体的重复使用次数会大大减少。
[0009]在本发明的进一步优选实施例中，解离时间为60min。因为发明人发现(参见图1)，当解离时间在0-60min之间时，解离率随着时间增加而逐渐升高，而当解离时间在60-180min之间时，复合物的解离达到饱和，进入平台期，因此60min的解离时间既能保证达到最高水平的解离程度，又能保证较高的时间效率。
[0010]根据本发明的解离方法，解离汞离子后的固定化核酸适体可至少重复使用5-10次，并且汞离子的解离效率在90%以上，甚至高达95 %。另外，每重复使用I次，玻片载体上固定的核酸适体吸附汞的效率和再次解离汞的效率至多降低2%。
[0011]根据本发明的第二方面，提供了一种利用含T碱基的核酸适体来检测汞离子的方法，其包括:
[0012]提供玻片载体；
[0013]对玻片载体执行羟基化处理以获得表面洁净的羟基化玻片载体；
[0014]对羟基化玻片载体执行硅烷化处理以获得硅烷化玻片载体；
[0015]将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上；
[0016]将固定在玻片载体上的核酸适体与单位体积的待测汞离子溶液反应预定时间以在玻片载体上形成T-Hg复合物；
[0017]从待测汞离子溶液中取出玻片载体；
[0018]利用权利要求1的解离方法对所取出的玻片载体执行解离；
[0019]利用电化学检测方法检测解离溶液中的汞离子浓度；
[0020]建立待测汞离子初始浓度与解离后浓度相对应的标准曲线；以及
[0021]根据解离后所检测的汞离子浓度确定待测汞离子初始浓度。
[0022]根据本发明的检测方法还可以包括:重复利用(固定在玻片载体上的)解离后的核酸适体来检测汞离子浓度。
[0023]根据本发明的一个优选实施例，还包括:从待测汞离子溶液中取出玻片载体之后(用双蒸水)立即执行清洗。在解离之前进行清洗可以在电化学检测过程中有效消除其它(金属)阳离子的干扰。
[0024]根据本发明的一个实施例，其中解离溶液的体积小于待测汞离子溶液的单位体积。该实施例尤其适用于微量汞离子存在而用常规方法无法检测出的情况，其可以利用本发明的核酸适体对汞离子(在解离溶液中)进行富集，直至可以检测出的程度。解离溶液的体积优选小于待测汞离子溶液(采样)单位体积的五分之一。
[0025]本发明对玻片载体执行羟基化处理没有特别要求，在一个优选实施例中，对玻片载体执行轻基化处理包括:
[0026]将98 %浓硫酸与30 %过氧化氢按体积比3:1混合均匀而形成羟基化处理液；
[0027]将玻片载体置于羟基化处理液中，加热至微沸条件下保持30min以进行羟基化反应；以及
[0028]冷却后用双蒸水清洗羟基化处理的玻片载体并晾干，从而得到表面洁净的羟基化玻片。
[0029]在本发明的一个实施例中，对羟基化玻片载体执行硅烷化处理包括:
[0030]将羟基化玻片载体浸入温度为45°C、浓度为4mmol/L的GOPS溶液并保持30min以进行娃烧化反应；以及
[0031]用乙醇清洗硅烷化处理的玻片载体并晾干，从而获得硅烷化玻片载体。
[0032]发明人发现，γ -缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GOPS)作为偶联剂可以良好地将本发明的含T碱基的核酸适体固定于玻片载体表面，并便于其进行后面与汞离子的结合和解离过程。
[0033]在本发明的一个实施例中，将含T碱基的核酸适体固定在硅烷化玻片载体上包括:
[0034]制备固定化缓冲液:含0.lmol/L 1_甲基咪唑，体积比为10%的二甲亚砜，以及pH为10 ；
[0035]将含T碱基的核酸适体溶于固定化缓冲液中以形成浓度为5-25 μ mol/L的核酸适体溶液；以及
[0036]取预定量的核酸适体溶液涂抹于硅烷化玻片载体上并在25 V -65°C之间反应30-120min，从而使核酸适体固定在玻片载体表面上。
[0037]在进一步的优选实施例中，含T碱基的核酸适体的结构为5’ _ττττττττττττττττττττ_3’。发明人偶然发现，这种结构的核酸适体对汞离子的结合和/或解离，尤其是对汞离子的解离有着惊人的高效。
[0038]在本发明的一个实施例中，将固定在玻片载体上的核酸适体与待测汞离子形成T-Hg复合物包括:
[0039]制备MOPS-NaNO3缓冲液:含 10mmol/L 3-(N-吗啡啉)丙磺酸(MOPS)，10mmoI/LNaNO3,以及pH为7.1 ;以及
[0040]将待测汞离子和固定在玻片载体上的核酸适体分别引入MOPS-NaNO3缓冲液并保持10-180min，从而在玻片载体上形成T-Hg复合物。
[0041]在进一步的优选实施例中，在检测T-Hg复合物之前用MOPS-NaNO3缓冲液再次冲洗T-Hg复合物。
[0042]在本发明的检测方法中，待测汞离子初始浓度与解离后浓