基于核酸适体荧光探针HCy1的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学检验测定技术领域，特别是设及基于核酸适体巧光探针的同型半 脱氨酸H切试剂盒及其检测方法。
【背景技术】
[0002] 同型半脱氨酸为一种含硫氨基酸，是生物体内蛋氨酸代谢的中间产物，与半脱氨 酸相比，侧链中多一个亚甲基。同型半脱氨酸是多种疾病的危险因子，目前认为同型半脱 氨酸增高是动脉粥样硬化所致屯、脑血管疾病最广泛、最强独立的致病因素。同型半脱氨酸 还与神经管崎形、帕金森病、老年性痴呆、慢性肾功能衰竭等多种疾病及某些药物、肿瘤的 影响有关。检测同型半脱氨酸的方法主要色谱法、免疫学方法和循环酶法。
[0003] 色谱法：气相色谱一质谱法测定同型半脱氨酸。该法可同时测定半脱氨酸、蛋氨 酸、脱硫離和甲基甘氨酸等多种物质。色谱法灵敏度高、特异性好，但样品处理、分离条件、 色谱柱制备诸多变异，使其难W标准化。而且HPLC设备价格昂贵、技术条件要求高，需专口 的维护人员，使其推广困难。
[0004] 免疫学法；该法应用特异性的抗S-腺巧同型半脱氨酸单克隆技术，采用巧光偏振 法或免疫法测定。同型半脱氨酸在S腺巧同型半脱氨酸水解酶和过量腺巧存在下，被转换 成S腺巧同型半脱氨酸；预稀释的混合物、抗-S-腺巧同型半脱氨酸单克隆抗体及标记的巧 光S腺巧同型半脱氨酸示踪物一同解育，仪器自动检测偏振光的改变，即可测出标本总同 型半脱氨酸水平。抗体巧光分析法和比浊法不能直接检测同型半脱胺酸，需一小时W上才 能出结果，操作步骤繁琐。
[0005] 循环酶法；是利用酶底物特性，放大祀物质（被测物）的检测方法。血浆氧化型同 型半脱氨酸经S己駿己基麟（TCE巧还原成游离型同型半脱氨酸，基于同型半脱氨酸甲基 转移酶，S腺巧同型半脱氨酸水解酶构成的循环酶体系W及脱氨酶辅酶体系的原理，分解产 物显色，用自动生化分析仪在600nm波长测OD值得出血浆中的同型半脱氨酸的含量。
[0006] 目前没有能够直接识别同型半脱氨酸的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度 设别同型半脱氨酸的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对屯、脑血 管等于同型半脱氨酸相关的疾病的的监控。
[0007] 核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和 力地域祀分子结的单链核巧酸分子。核酸适体可W通过配体指数富集系统进化技术 (Systematic Evolution of Ligands by Exponentia化nrichment，SELEX)筛选获得。沈LEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核巧酸（由两端的固定序列和中间的随机序列 组成）文库，通过施加选择压力（结合祀目标，淘选与祀目标高度特异结合片段的过程）， 并结合体外扩增技术，经过多轮的循环选择富集，获得与祀物质高度特异结合的寡核巧酸 分子，可W是RNA也可W是DNA，长度一般为25?60个核巧酸。核酸适体主要通过发生 适应性折叠，通过氨键、疏水堆积作用、范德华力与祀分子相互作用，与插入或包被的祀分 子形成稳定的=维空间结构。核酸适体不与祀分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构， 5'和3'两端相互游离。与祀分子结合时，祀分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的 5'端和3'端都将参与与祀分子特定区域（类似于与抗体结合的抗原位点）的相互作用，导 致5'和3'两端相互靠近。该一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种分子信 标设计利用了巧光染料巧分子。当一个激发态巧分子和另一个基态巧分子近距离遭遇的时 候能形成激发态二聚体，能在比巧单体波长更长的位置释放一个光子。巧激发态二聚体发 射峰在480到500nm，而巧单体的发射峰在370到400nm之间。另外，巧分子巧光寿命比生 物样品中的非特异激发巧光的寿命长，检测时可W在非特异激发巧光消失后，再来收集激 发态二聚体的巧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别同型半脱氨酸的核酸适体 可W应用于同型半脱氨酸的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。
[000引核酸适体与祀物质结合所呈现的高敏感性和高特异性，使其在疾病诊断中具有 良好的应用前景，尽管目前成熟的临床应用报道较少，但应用适体检测祀蛋白的研究却不 断增多，基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新 一代针对特定蛋白的分子药物或祀向载体，W及用于检测其特异性识别的祀分子物质。但 是目前基于核酸适体的针对于同型半脱氨酸H切诊断试剂还很缺乏，且针对于同型半脱氨 酸H切的核酸适体巧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操 作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸H切试剂盒 及其检测方法。
[0010] 本发明的方案是通过该样实现的：
[0011] 一种基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒，其特征在于，主要成分包括： 含NH4Cl、Tris、邸TA-N32的红细胞裂解液；含MgCls的0. 2M磯酸缓冲液；同型半脱氨酸标准 品；同型半脱氨酸核酸适体巧光探针；所述同型半脱氨酸核酸适体巧光探针为5'和3'两 端分别标记巧光巧分子单体的核巧酸单链，该核巧酸单链序列为；gggaggcatg atggtgtagc cgttacgagc actggtaaca ttggaaccco 该序列命名为 HCyl〇
[0012] W上所述的一种基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒，所述含NH4CI、 Tris、邸TA-N32的红细胞裂解液为含有1?280mmol/L畑典1，1?34mmol/L Tris, 1? 2mmol/LEDTA-Na2, pH 7. 0 ?7. 2 ;所述含 MgCla的 0. 2M 磯酸缓冲液为含有 1 ?lOmmol/L MgClao
[0013] W上任一所述的一种基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒，其特征在 于，所述含畑典1、Tris、邸TA-N32的红细胞裂解液、含MgCl 2的0. 2M磯酸缓冲液、同型半脱 氨酸标准品、同型半脱氨酸核酸适体巧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需 加水溶解的干粉状态。
[0014] W上所述的一种基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒，其特征在于，该 试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的同型半脱氨酸浓度。
[0015] 一种用W上任一所述基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒来检测同型 半脱氨酸浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：
[0016] (1)血样裂解；将血样和含N&CUTris、邸TA-Na2的红细胞裂解液按1:0. 5?5体 积比混匀，静置5?30min，再中速离屯、5?lOmin，收集上清液；
[0017] 似混合卵育；混合卵育：取20?100 y 1步骤1)得到的上清液和30?50ul的 用含MgCls的0. 2M磯酸缓冲液，溶解同型半脱氨酸核酸适体巧光探针得到的同型半脱氨酸 核酸适体巧光探针试剂混合，室温下卵育5?15min，使同型半脱氨酸核酸适体巧光探针与 血样充分结合，得到测试液；
[0018] (3)巧光检测；巧光检测仪检测步骤2)得到的测试液50ul，在巧光检测仪巧光激 发后，读取巧光激发后20至100ns时间段内波长在480?500皿的巧光值；
[0019] (4)结果计算：使用生物医学作图软件，参照同型半脱氨酸标准样品制作的标准 曲线，结合步骤3)中检测到的巧光值计算出血样中同型半脱氨酸的浓度。
[0020] W上所述的生物医学软件为Sigma plot软件，于市面上可W购买到。
[0021] W上所述的一种用基于核酸适体巧光探针的同型半脱氨酸试剂盒来检测同型半 脱氨酸浓度的方法，其特征在于，所述同型半脱氨酸核酸适体巧光探针试剂中同型半脱氨 酸核酸适体巧光探针浓度为200?400nmol/L，其特性还在于，所述同型半脱氨酸核酸适 体巧光探针为5'和3'两端分别标记巧光巧分子单体的核巧酸单链，该核巧酸单链序列为： 咨咨咨a咨咨cat咨at咨咨t咨ta咨C cgttacgagc act咨咨taaca tt咨咨aaccc。
[0022] 同型半脱氨酸核酸适体巧光探针不与同型半脱氨酸结合时，核酸适体处于比较松 散的结构，5'和3'两端的巧分子单体相互游离，巧光激发后发射波长在370