与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体设及一条基于氧化石墨締 SELEX技术筛选获得的 与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体，为样品中痕量漆沟藻毒素1和4的分离富 集，漆沟藻毒素1和4的快速检测，中和或括抗漆沟藻毒素1和4药物的制备，W及水体中毒素 的去除奠定了基础。
【背景技术】
[0002] 麻搏性贝类中毒是Ξ大世界性海洋生物公害之一。漆沟藻毒素1和4 (Gonyautoxinl and Gonyautoxin 4，GTX1 and GTX4)及其类似物漆沟藻毒素2和3(GTX2 and GTX3)、石房始毒素（Saxitoxin，STX)和新石房始毒素(neoSTX)是麻搏性贝类毒素中最 具代表性的神经毒素。GTX1和GTX4可通过水中食物链在鱼类和贝类体内蓄积，人类误食运 些染毒的水产品后就会引起麻搏性贝类中毒。中毒的症状主要包括四肢肌肉麻搏、头痛恶 屯、、流诞发烧、皮疹等。中毒严重时，则会出现呼吸困难，咽喉紧张;随着肌肉麻搏不断扩展 加重，最终导致死亡。麻搏性贝类毒素的毒性很强，摄入Img就可致人死亡，对动物神经系统 和屯、血管系统有高度特异性，使人中毒的范围在600-5000MU之间(Mu为毒力单位，IMu是指 使18-22g的小白鼠在15min内死亡的毒力），致死剂量为3000-30 OOOMu。世界各地都有包括 GTX1和GTX4在内的麻搏性贝类毒素的分布，尤其是欧洲及北美一些国家。我国东南沿海一 带地区也经常发生食用有毒始类、螺类、贝类引发的人中毒事件。由于染有GTX1和GTX4的贝 类严重地危害着人类的健康和全球贝类产业的发展，因此对于海洋生物毒素 GTX巧日GTX4的 检测显得尤为重要。长期W来，一直用于GTX1和GTX4检测的方法是国际上公认的小鼠生物 学法。然而，运种方法的灵敏度低，成本高，W及需要使用大量的动物等。也有一些其他的分 析方法的建立例如高效液相色谱法化PLC)，质谱(MS)，巧光(fluorescence)及各种技术联 用等，特别是液质联用技术已经被欧盟确定为首要的检测方法。但是，运些方法需要昂贵的 仪器设备、专业的技术人员、检测耗时长W及毒素的标准品难W获得等问题。因此，仍迫切 需要研发一种灵敏、稳定和廉价的检测系统用于海洋生物毒素 GTX1和GTX4的现场快速侦 测。对于一种现场快速检测方法而言，最关键的部分是分子识别探针，如常用的抗体和受体 等。
[0003] 核酸适配体是一种具有功能的单链DNA或DNA，是通过体外筛选技术SELEX(指数富 集性配体系统进化，Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)从 随机核酸文库中获得的寡核巧酸序列。运些适配体序列通过分子间的作用力，例如氨键，范 德华力，芳香环堆积作用力等折叠成稳定的独特的Ξ维空间，而与祀分子高亲和力，强特异 性的结合。相对于抗体而言，适配体存在许多优势，包括其稳定性高，免疫原性低，组织渗透 性强，一致性好，不需要免疫动物等，故适配体作为一种新型的分析识别元件在检测，诊断 和治疗方面都很有前景。近年来已有学者将适配体应用于海洋生物毒素检测领域，与生物 传感器平台结合，研发了许多快速、新颖的检测方法而备受关注。
[0004] 然而，关于与GTX1和GTX4特异性结合的分子识别探针，与GTX1和GTX4特异性结合 的高亲和力适配体，w及该适配体的亲和常数鉴定、优化及应用尚无相关报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一条与漆沟藻毒素1和4特异性结合的高亲和力适配体。本 发明的第二目的在于提供通过截短的方法对该适配体进行优化得到一条特异性结合GTX1 和GTX4亲和力更高的适配体(G018-T-d)。本发明的再一目的是提供上述适配体在制备样品 中痕量漆沟藻毒素1和4的分离富集试剂中、在制备漆沟藻毒素1和4检测试剂或试剂盒中、 在制备预防或治疗漆沟藻毒素1和4中毒药物中，W及在制备去除水体中漆沟藻毒素1和4制 剂中等多方面的应用。
[0006] 本发明的主要技术方案是:基于氧化石墨締 SELEX技术筛选得到一条与漆沟藻毒 素1和4特异性结合的高亲和力适配体。该单链DNA适配体可用于样品中痕量GTX1和GTX4的 分离富集，GTX巧日GTX4的分析检测，中和或括抗漆沟藻毒素巧日4药物的制备，W及水体中毒 素的去除。
[0007] 本发明的第一方面，是提供了一条与漆沟藻毒素1和4(GTX1和GTX4)特异性结合的 高亲和力适配体，具有如下所示的通式：
[000引 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3';其中，N代表碱基A，T， C，G中任一个，N40代表长度为40bp的随机序列。
[0009] 优选的，所述单链DNA适配体选自W下序列中的任一条：
[0010] 609:如沈910^:2所示；
[0011] G012:如沈Q ID N0:1 所示；
[0012] 6017:如沈910備:4所示；
[0013] 6018:如沈910備：5所示；
[0014] 6034:如沈910備:6所示；
[001引 6037:如沈910備:3所示。
[0016] 本发明的第二方面在于提供W上述单链DNA适配体为基础，通过截短的方法进行 优化得到一条特异性结合GTX1和GTX4亲和力更高的适配体，命名为G018-T-d，如SEQ ID NO: 14所示。
[0017] 所述的G018-T-d适配体，在其5'端或3'端可W进行生物素、巧光分子、同位素、电 化学、酶或琉基等化学修饰。
[0018] 本发明的第Ξ方面，是提供了上述适配体在制备样品中GTX巧日GTX4(GTX1和GTX4) 的分离富集试剂中的应用。
[0019] 本发明还提供了上述适配体在制备漆沟藻毒素1和4检测试剂或试剂盒中的应用。 所述的试剂或试剂盒可用于快速检测水体或水产品中的GTX1和GTX4。
[0020] 本发明还提供了上述适配体在制备预防或治疗漆沟藻毒素1和4中毒药物中的应 用。所述的药物也为中和漆沟藻毒素1和4的药物、或为漆沟藻毒素1和4括抗剂等。所述的药 物可W缓解、治愈漆沟藻毒素1和4中毒导致的恶屯、、呕吐、腹泻、神经肌肉麻搏、呼吸无力、 血压下降、屯、率减慢、屯、律失常等症状。
[0021] 本发明还提供了上述适配体在制备去除水体或水产品中漆沟藻毒素1和4制剂中 的应用。所述的制剂可W完全去除水体或水产品中的漆沟藻毒素1和4,或者降低水体或水 产品中漆沟藻毒素1和4的含量使其达到联合国卫生组织和联合国粮农组织规定及推荐的 标准W下。
[0022] 本发明鉴于GTX1和GTX4稳定性高，水溶性好的结构特点，设计了基于氧化石墨締 SELEX技术，筛选获得与GTX1和GTX4高亲和力、强特异性结合的单链DNA适配体。运些适配体 作为与GTX1和GTX4特异性结合的分子识别探针，具有亲和力高、特异性强、稳定性好、免疫 原性低、易制备、修饰和标记等优势。可用于样品中痕量GTX1和GTX4的分离富集，GTX1和 GTX4的分析检测，中和漆沟藻毒素1和4药物的制备，括抗漆沟藻毒素巧日4药物的制备，W及 水体中毒素的去除。
[0023] 因此，本发明的适配体面向实际应用具有巨大的潜力。
【附图说明】
[0024] 图1是基于氧化石墨締的适配体筛选的示意图。
[0025] 图2是每一轮筛选中适配体与祀分子GTX1和GTX4的结合率。
[0026] 图3是G018的截短序列经mfold软件预测得到的二级结构图。
[0027] 图4是适配体G018-T-d亲和力和特异性鉴定图。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。
[0029] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人， 分子克隆：实验室指南（New York:Cold Spring 化rbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除 非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此 夕h任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实 施方法与材料仅作示范之用。
[0030] 实施例1.随机ssDNA文库及其引物的构建
[0031 ] 1.构建长度为80个核巧酸的随机ssDNA文库
[0032] 5' -AGCAGCACAGAGGTCAGATG-N40-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3';其中，N代表碱基A，T， C，G中任一个，N40代表长度为40bp的随机序列。
[0033] 2.引物的构建
[0034] 上游引物：5'-46〔46〔4〔464661^464了6-3'，沈9 10備：15 [003引 下游引物1:5' -TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'，SEQ ID NO: 16
[0036] 下游引物2:5' -poly(dA20)-Spacerl8-