专利名称：一种基于表面等离子共振技术的塑料玩具中有害化合物检测方法
技术领域：
本发明涉及一种塑料玩具中有害化合物检测技术。特别是基于表面等离子体共振技术，通过核酸适配体与未标记、标记样品进行特异性竞争识别，采用凝血酶适配体修饰的传感元件间接检测塑料玩具中有害化合物的方法。
背景技术：
玩具一直是婴幼儿的亲密伙伴，但是也会带来健康问题，有害化合物残留就是潜藏在塑料玩具中的隐形杀手。婴儿玩具中涉及有害化学物质的种类繁多，如树脂及稳定剂、 增塑剂、着色剂等添加剂等。近年来出现的双酚A事件引起了人们对塑料玩具中有害化学物质的广泛关注，双酚A是制造环氧树脂、聚碳酸树脂、聚苯こ烯树脂的主要原料，又是用于酚醛树脂、聚氯こ烯、抗氧化剂等的稳定剂。在婴儿玩耍过程中，误舔误食均有可能引起双酚A从玩具中迁移出来，而直接进入体内，对婴儿发育、免疫力造成影响，甚至致癌。2011年，欧盟颁布了 “新玩具安全指令”，明确规定在欧盟市场销售的玩具必须符合新指令及适用标准，表明欧盟相关贸易壁垒再次升级。因此，塑料玩具中的有害化合物残留越来越引起了国内外的普遍重视。传统检测有害化合物残留的方法主要有液相色谱、气相色谱、气液质联用仪等。这些方法虽然具有灵敏度高、使用范围广等优点，但价格昂贵、处理复杂、实验过程繁琐费吋，所用大量的有机试剂易污染环境，不能进行在线检測。目前，免疫分析技术是有害化合物快速检测中应用最普遍的技木。然而，现有免疫检测技术所用试剂盒和传感器往往具有专ー性；免疫标记物也存在不稳定、容易失活等缺点，限制了相关免疫分析技术的进一歩发展。表面等离子体共振技术因其具有高灵敏度、操作简单、响应快、无须标记与耗样量少等优点，已广泛用于生化检测领域。该技术不仅可以检测分析物，而且可以测定分子间相互作用的动力学常数，可以为塑料玩具中有害化合物快速检测提供一种简便可靠的方法；但与酶联免疫吸附法、生物传感器检测法以及荧光分析法相比，仍然存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此，如何实现同一传感芯片检测不同有害化合物已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。
发明内容
为了解决现有有害化合物免疫分析技术存在的传感专一性、抗体稳定性差、耗材量大、造价昂贵等问题，同时极大提高有害化合物的检测限，本发明提供了一种基于表面等离子体共振仪检测塑料玩具中有害化合物的检测方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点，满足对玩具中各种有害化合物的检测要求。本发明的技术方案为一种应用表面等离子体共振仪的塑料玩具中有害化合物检测方法，利用同一传感芯片对不同有害化合物的含量进行检测；其特征在于包括以下步骤
(一)传感芯片表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50 L浓度为l-50ii g/L已标记生物素的凝血酶适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上凝血酶适配体； (ニ)对待测有害化合物进行凝血酶标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基；
(三)标准溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置有害化合物的标准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测有害化合物的标准溶液和凝血酶标记的待测有害化合物分充分混合后，竞争结合有害化合物相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中凝血酶标记的有害化合物应不少于加入的适配体量；
(四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线；
(五)定量检测对于未知含量的有害化合物进行检測，同样按照步骤(三)进行；采用表面等离子体共振检测仪记录有害化合物的光谱图；将光谱图中残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出塑料玩具中有害化合物的浓度值；
(六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它有害化合物检测。所述标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。可以采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤
(1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰；
(2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液；
(3)通入5-50UL浓度为1-50 y g/L生物素修饰的凝血酶适配体溶液，进行在线偶联至
基线稳定；
(4)重复步骤(2)至(3)，获得凝血酶适配体修饰的传感芯片。可以采用凝血酶标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。所述步骤(四)和(五)中通过检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物的浓度值，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种有害化合物的检测。本发明的有益效果
(I)本发明解决塑料玩具中有害化合物检测芯片的专一性差问题，引入凝血酶作为标记分子，采用生物素标记的适配体对表面等离子体共振传感芯片进行修饰，将塑料玩具中有害化合物的测量转换为对凝血酶的测量，实现传感芯片的通用性，使用同一传感芯片对塑料玩具中不同有害化合物进行检測。具体检测原理见附图I ;(2)本发明解决芯片稳定性差问题，采用适配体作为芯片表面通用配体，再生容易。相对抗体可重复使用性强，极大地延长了芯片的使用寿命，降低检测成本；
(3)本发明解决试剂消耗量大问题，采用待测样品中有害化合物和凝血酶标记的危有害化合物竞争识别有害化合物的适配体时，相对于以往的竞争抑制结合思想，无须加入过量的适配体，既实现了响应信号放大，也节省了试剂消耗；
(4)本发明提高了检测灵敏度，操作中可选用纳米粒子修饰的有害化合物适配体，基于表面等离子体共振检测时，信号显著增加。
图I是本发明所述的塑料玩具中有害化合物检测原理图；其中0为有害化合物，I为凝血酶标记的有害化合物，.为有害化合物的适配体，Ij为凝血酶的适配体，.为纳米粒子。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作以详细描述。实施例选择塑料玩具中两种典型有害化合物双酚A和こ醇胺为检测对象，具体操作步骤如下
(1)传感器表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入20yL浓度为30y g/L已标记生物素的凝血酶适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上凝血酶适配体；
(2)分子探针标记物偶联将待测物通过戊ニ醛法与凝血酶进行偶联标记，标记方法根据待测物基团不同选择，包括EDC/NHS法、戊ニ醛法等，如双酚A，可采用EDC/NHS法与凝血酶连接，待用；
(3)标准溶液配制称取双酚A标准品10mg，溶解于0. 02mol/L (pH = 7. 4)磷酸盐缓冲液定容至10 mL,即为I mg/mL的标准贮备液；用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，浓度在 ng/mL ii g/mL 级，依次为 Ong/mL, 500ng/mL, I u g/mL, 2 u g/mL,4 ii g/mL,6 u g/mL ；
(4)标准曲线绘制将上述浓度为0ng/mL未标记的标准溶液与适量的凝血酶标记双酚A溶液充分混合；再加入双酚A相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中凝血酶标记的双酚A应不少于加入的适配体量；采用表面等离子共振谱仪测量，通入0. 02mol/L(pH =7. 4)磷酸盐缓冲液作为测量基准，然后泵入待测混合样品，待表面等离子体共振响应值稳定后，记录表面等离子体共振光谱 (5)通入0.02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，冲洗传感芯片表面，破坏凝血酶与适配体的结合,完成传感元件再生；
(6)浓度由低到高，依次通入其他浓度(500ng/mL-600iig/mL)的待测标准样品测量方法同(4)，获得相应表面等离子体共振光谱图；取双酚A的表面等离子体谱图稳定值，绘制标准曲线，并进行多项式曲线拟合，获得浓度-稳定值关系回归曲线方程；
(7)传感芯片再生后，将实际未知浓度待测样品按步骤(4)与适量凝血酶标记双酚A溶液充分混合；泵入的表面等离子体共振谱仪中，同时记录双酚A的光谱图，确定相应稳定值，代入各自标准曲线，确定各组分含量，检测限可达ng/mf u g/mL级，低于国家规定的最闻允许含量；
(8)再次通入0. 02mol/L (pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液,冲洗表面等离子体共振传感芯片，进行芯片再生，用于こ醇胺的检测；将适配体变换为こ醇胺适配体，而双酚A-凝血酶偶联物变为こ醇胺-凝血酶偶联物；こ醇胺检测中步骤(3)中配制的溶液浓度改为Oy g/mL, 100 u g/mL, 200 u g/mL, 500 u g/mL, lmg/mL, 2mg/mL。检测限可达 ii g/mL 级,低于国家规定的最闻允许含量。本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中以双酚A和こ醇胺为例进行详细描述，但本发明同样适用于塑料玩具中其他有害化合物的測定，如2，6-ニ叔丁基酚、苯胺等的精确检测和定性分析。传感器表面再生所用溶液选择0. 02mol/L(pH = 2. 4)甘氨酸-盐酸溶液，但还可以选择盐溶液或弱酸弱碱溶液或高离子强度电解质溶液，如0. 5 mol/L氢氧化钠溶液或10 mmol/L甘氨酸/盐酸缓冲溶液，破坏凝血酶与适配体的结合，因此上述内容 均在本发明保护范围之内。此外，根据实施例I的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，准确度提高2 10倍，探头寿命延长10倍以上，现有表面等离子体检测技术不能准确检测的双酚A等小分子量(〈lOOODa)物质，可以采用本发明的方法获得准确的检测結果。
权利要求
1.一种应用表面等离子体共振技术的塑料玩具中有害化合物的检测方法，利用同一传感芯片对不同有害化合物的残留量进行检测；其特征在于包括以下步骤 (一)传感芯片表面适配体固定选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50 L浓度为l-50ii g/L已标记生物素的凝血酶适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上凝血酶适配体； (ニ)对待测有害化合物进行凝血酶标记，标记方法根据待测物基团不同，选择EDC/NHS法交联羧基与氨基或戊ニ醛法交联两个氨基； (三)标准溶液配制用0.01-0. lmol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液配置有害化合物的标准样品储备液，储备液浓度为0. Ing/mL至lmg/mL,用磷酸盐缓冲液将储备液配制成不同浓度的标准溶液，取不同浓度未标记待测化合物的标准溶液和凝血酶标记的待测有害化合物分充分混合后，竞争结合有害化合物相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中凝血酶标记的有害化合物应不少于加入的适配体量； (四)建立标准曲线采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100 u L待测混合样品，记录下表面等离子体共振仪光谱图，通过检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物；取不同浓度待测样品的表面等离子体共振谱图稳定值，绘制工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得回归标准曲线； (五)定量检测对于未知含量的有害化合物进行检测，同样按照步骤(三)进行；采用表面等离子体共振检测仪记录有害化合物的光谱图；将光谱图中残留组分的稳定值代入相应的回归曲线方程，计算出塑料玩具中有害化合物的浓度值； (六)通入0.01-0. 05mol/L (pH为2_3)的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它有害化合物检测。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述标记方法包括EDC/NHS法或戊ニ醛法。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用核酸适配体为识别分子，核酸适配体序列与待测物直接相关。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(一)传感器表面适配体固定，包括如下步骤 (1)将链霉亲和素SA修饰的传感芯片插入表面等离子体共振检测仪中，在工作通道中进行在线传感表面修饰； (2)通入0.02mol/L (pH = 7. 4)的磷酸盐缓冲液； (3)通入5-50UL浓度为1-50 yg/L生物素修饰的凝血酶适配体溶液，进行在线偶联至基线稳定； (4)重复步骤(2)至(3)，获得凝血酶适配体修饰的传感芯片。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于采用凝血酶标记待测物，与未标记样品一起与核酸适配体发生特异性竞争识别。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(三)中纳米粒子可以是金属纳米粒子或磁性纳米粒子或高分子化合物。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(四)和(五)中通过检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物的浓度值，提高表面等离子体传感芯片的可重复利用性，适用于各种有害化合物的检测。
全文摘要
一种基于表面等离子共振技术的塑料玩具中有害化合物的检测方法，属于有害化合物残留检测技术领域。本发明包括传感表面适配体固定、样品标记、样品检测、传感元件再生四个步骤，利用同一传感芯片对不同有害化合物的残留量进行检测；其特征在于以凝血酶作为标记分子探针，将传感芯片表面连接凝血酶适配体；对样品进行一系列预处理，加入待测有害化合物的凝血酶标记物，混合后竞争结合金属纳米粒子修饰的有害化合物相应的适配体；利用表面等离子体共振检测仪检测凝血酶的含量，间接检测有害化合物；并对传感芯片进行再生，用于检测其它有害化合物。本发明为塑料玩具中有害化合物的检测提供了一种稳定性高、可重复性强、灵敏度高的通用检测方法，实现了同一表面等离子体共振传感芯片对不同有害化合物的检测，具有极高的通用性。
文档编号G01N21/55GK102628801SQ20121011072
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者王利兵, 苏荣欣, 黄仁亮 申请人:王利兵