专利名称：用于治疗给药镜像适配体引起的不良反应的含l-核酶的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及L-核酶用于制备药物组合物的用途、包含所述L-核酶的药物组合物和制备所述药物组合物的方法。发明背景和现有技术
适体通常是双链D-核酸，其特异性地结合任何靶分子，类似于抗体/抗原反应 (Ellington, A. D.等人，Nature 346:818-822 (1990))。例如通过 SELEX 方法从核酸库中分离给定靶分子的特异性适体(Tuerk, C.等人，Science 249:505-510 (1990))。在治疗领域，适体的用途尤其是结合和从而抑制不合意的代谢产物。在这方面，仅仅示例性提及致癌基因产物。适体的治疗用途中的缺陷是其具有不利的药代动力学，即非常快速地降解，例如被内源核酸酶降解。与此独立地，适体总归是相对小的分子，因此，其经肾脏相对快地排泄。镜像适配体(Spiegelmer)本质上是适体，但是与适体不同在于其是由L-核苷酸形成的。镜像适配体可以是单链的或双链的。通过使用L-核苷酸，防止了内源核酸酶的降解，因此，相当大地改善了药代动力学，即在血清中的保留时间延长了。因此，在参考文献 Boisgardj R 等人，Eur Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 32:470-477 (2005)中，其描述了非功能性镜像适配体在2小时的时间段内在代谢上是非常稳定的。镜像适配体的诊断用途也描述在该参考文献中，其中镜像适配体与例如放射性报道子物质(Iteportersubstanz)结合。给定靶分子的特定镜像适配体可以例如如在参考文献Klussmarm，S.等人，Nat Biotechnol 14:1112-1115 (1996)中描述的进行鉴定。关于镜像适配体及其可能的治疗应用，也可以参见 Vater, A.等人，Curr Opin Drug Discov Devel 6:253-261 (2003)。在镜像适配体的治疗应用中，迄今为止，已经假定镜像适配体不是免疫原性的 (Wlotzka 等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:8898-8902 (2002)) 然而，在本说明书中描述的研究表明，在生物体中，L-核酸决不是必然没有副作用。因此导致，当使用镜像适配体给药至患者情况下，必然存在不可忽视的不合意的生理学不良反应的风险，例如免疫反应和/或与内源RNA (包括，调节RNA)的不合意的酶促反应。特别地，鉴于在1期临床试验中采用单克隆抗体TGN1412的负面经验，和基于上述提及的内容镜像适配体的保留时间相对非常高的背景，期望当给药镜像适配体时有针对所用镜像适配体的解毒剂，从而在出现不合意的生理学不良反应时，该解毒剂可以立即给药，在血清中的镜像适配体水平可以在短时间内降低。根据其它内容，即核酶催化的立体选择性狄尔斯-阿德尔反应，L-核酶是已知的， 就此可以提及参考文献 kelig, B.等人，Angew. Chem. Int. , 39:4576-4579 Q000)和 Seelig, B.等人，Angew. Chem. 112:4764-4768 (2000)。本发明的技术问题
因此，本发明基于提供针对治疗所用的镜像适配体的解毒剂的技术问题。
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本发明的主要特点
为了解决该技术问题，本发明教导L-核酶用于制备药物组合物的用途，其中L-核酶能够在L-RNA的靶序列区切割L-RNA，特别地用于制备治疗不合意的生理学不良反应的药物组合物，所述不良反应特别地是由于给药包含L-RNA的治疗分子而引起的免疫反应和/或 L-RNA与内源RNA (包括调节RNA)的不合意的酶促反应。本发明首先是基于令人惊奇地发现与现有的假设相反，镜像适配体不是必然地没有不良反应，而是可能能够切割生物体中天然存在的核酸，从而产生不能预料的不良反应。本发明是基于建立在下面技术教导上的发现，提供L-核酶，所述L-核酶特异性切割已经给药的镜像适配体，从而破坏其生理学功效，特别是不合意的不良反应。镜像适配体的实例是Spiegelmer、N0XC89、N0XA42、N0XA50、NOXBl 1、NOXAl2, N0XE36、N0XF37 (全部来自 NOXXON AG)、来自Eli Lilly & Co.公司的镜像适配体、来自ARCA biopharma Inc.公司的 NU172、ARCHEMIX、ARC1905、ARC1779、ARC183、ARC184、E10030、NU172、REG2、REGl (全部来自 Archemix Corp.) >AS1411>AS1405 ( ^ g Antisoma Research Ltd.) Dicerna Pharmaceuticals Inc.的 DsiRNA、来自 BexCore Inc.的 RNA Aptamer BEXCORE、来自 Elan Corp Plc.,或Macugen公司的ELAN。因此，当给药镜像适配体时观察到不合意的不良反应之后，通过给药这种核酶，可以快速、有效和高度选择性地从代谢中除去不合意的不良反应的原因，而且给药L-核酶的不良反应的危险非常地低。后者不仅是基于来自L-核苷酸构建L-核酶的结构，而且还基于L-核酶的高选择性，即对准镜像适配体的靶序列。因此，获得了高度有效且高度选择性的抗治疗使用的镜像适配体的解毒剂，并且可以有效、快速且没有副作用地对抗不合意的镜像适配体的不良反应。原则上，对于抗任何RNA分子，无论是否由D-或L-核苷酸组成，都有可能构建特异性核酶，其切开并因此切割RNA分子的靶序列。因此，核酶的一个基本性质是核酶序列-特异性结合靶序列。然而，这还意味着对于任何靶序列，都可以通过使包含切割位点的核酶的部分序列杂交靶序列的方式制备核酶的部分序列。因此，在本发明范围内，基于特定靶序列在结构上给出仅特定核酶部分序列是不合适的。因此，在实施例中给出的靶序列和核酶部分序列仅仅是示例，本领域技术人员可以容易地确定对于镜像适配体的每个给定的靶序列序列适配的核酶部分序列，即杂交的核酶部分序列，并基于核酶部分序列的信息采用常见技术手段合成该核酶。原则上，所述治疗分子可以是镜像适配体，或者L-RNA可以共价结合适体。该后一情形可以例如在适体稳定地抗核酸酶的情况下存在。然后，本发明的治疗益处是通过切割L-RNA，适体可接近核酸酶，由此最后可以相对短时间内从血清中消除引起不良反应的适体。然而，L-核酶共价结合适体或抗体也是可能的。在此情况下，由于适体或抗体与细胞表面的相互作用，可以例如选择适体或抗体，L-核酶和适体或抗体的全部结构都被引入到细胞中。优选地，所述L-核酶是锤头状核酶。锤头状核酶具有保守区，尤其具有三联体GUH(H不是鸟嘌呤，优选C)或二联体UH(H如上)。对于前者，可以参见
图1。对于后者，可以参见参考文献 Usman, N,等人，The Journal of Clinical Investigation, 106 (10):1197-1201 (2000)。在此，核苷酸N’和N是任意碱基，其根据靶序列选择茎(Stem) I和III区。本质上，在构建抗靶序列的L-核酶时如此进行首先指定靶序列，例如镜像适配体，其中所述靶序列必须包含三联体GUH或二联体UH。然后，在三联体GUH或二联体UH的两端，通常在每种情况下，补加4-10或4-11，特别是6-8或6-9个核苷酸，其序列对应于靶序列的序列。如此，获得了包含三联体GUH或二联体UH的靶序列的拷贝，其包含11至23 个核苷酸。然后，如图1所示，催化的锤头状序列插入所述拷贝的两端之间。因此，合适的催化性锤头状序列的一个实例是
5’ -CUGANGAGN，CN，NNNNNGNCGAAAC-3，或 5’ -CUGANGAGN，CN，NNNNNGNCGAAAN-3，
(N=任意碱基，其中在图1中，彼此相对的N和N’必需形成相同或不同的碱基对) 其在3’ -末端结合与三联体GUH或二联体UH的5’侧的靶序列互补的序列的核苷酸， 和在5’ -末端结合与三联体GUH或二联体UH的3’侧的靶序列对应的序列的核苷酸。在一个优选的实施方案中，所述催化性锤头状序列是 5’ -CUGANGAGNUCGGAAACGACGAAAC-3，，或
5’ -CUGANGAGNUCGGAAACGACGAAAN-3’
(N=任意碱基，其中在图1中，彼此相对的N和N’必需形成相同或不同的碱基对) 另外，序列
3，- (N) 4_6GGUAUAGAGUGCUGAAUCC-5，
可以设置在催化性锤头状序列的5’ -端，以便获得需要相对低Mg-离子浓度的锤头状核酶。所述药物组合物包含至少剂量相当于L-RNA给药剂量的L-核酶，优选地包含剂量相当于L-RNA给药剂量2-10倍的L-核酶，以分子数或摩尔数计。与L-RNA的剂量相比的过量剂量是推荐的，以确保待除去的所有L-RNA都反应掉。根据本发明预期的所述相对数量比例中的绝对剂量严格地基于L-RNA的指定剂量，因此，可以由本领域技术人员根据L-RNA 的指定剂量容易地测定和确定。在本发明的一个优选的实施方案中，所述药物组合物还包含核酸，特别是5-至 20-聚体的，其能够在其靶序列区融合双链L-RNA。这些是杂交与靶序列相邻的部分序列的序列。因此，由于L-RNA的三级结构，因为立体原因而通常不能接近的L-RNA的⑶C区变得能由L-核酶接近。本发明进一步涉及一种包含L-核酶的药物组合物，其用于治疗由于给药包含 L-RNA的治疗分子引起的不合意的生理学不良反应，特别是免疫反应。对于药物组合物，所有上述和随后的详细描述也类似地适用。最后，本发明涉及一种用于制备所述药物组合物的方法，其中制备和合成L-核苷酸序列，该序列能够切割L-核糖核苷酸的给定序列，特别是包含三联体GUC的L-核糖核苷酸的给定序列与结合该三联体的任意5’ -侧和3’ -侧的其它任何序列，其中所述L-核酶预期以药理学有效剂量给药。典型地，所述L-核酶与盖仑助剂和/或载体混合。原则上，一种或多种生理学相容的助剂和/或载体可以与所述L-核酶混合，并且该混合物可以按处方配置成用于局部或全身给药，特别地用于口服给药、肠胃外给药、在目标器官输注或灌注、注射给药(例如静脉注射、肌肉注射、囊内注射或腰髓内注射)、应用在牙囊(Zahntasch)(牙根和牙龈之间的间隙)和/或吸入给药。添加剂和/或助剂的选择取决于选择的剂型。根据本发明的药物组合物的盖仑制剂可以采取本领域常见的方式。 作为离子化合物的抗衡离子，例如可以考虑Mg++、Mn++、Ca++、CaCl\ Na+、K+、Li+或环己铵，或 Cl_、Br—、乙酸根、三氟乙酸根、丙酸根、乳酸根、草酸根、丙二酸根、马来酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、水杨酸根、腐胺根(Putrecin)、尸胺根、亚精胺根、精胺根等。合适的固体或液体盖仑剂型为例如颗粒剂、粉剂、锭剂(Dragee)、片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、汁液、混悬剂、乳剂、滴剂或注射溶液(静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射)或喷雾溶液(气雾剂)、用于干粉末吸入的剂型、透皮系统、和具有缓释活性物质的制剂，为了制备这些剂型采用了常用助剂，比如载体、崩解剂、粘合剂、包衣材料、溶胀剂、润滑剂或滑动剂、调味剂、甜味剂和增溶剂。也可以将活性物质包囊在优选可生物降解的纳米胶囊中，例如用于制备吸入制剂。 作为助剂，提及例如碳酸镁、二氧化钛、乳糖、甘露醇及其它糖类、滑石、乳蛋白、明胶、淀粉、 纤维素及其衍生物、动植物油比如鱼肝油、葵花油、花生油或芝麻油、聚乙二醇和溶剂，比如无菌水和一元醇或多元醇例如甘油。根据本发明的药物组合物可以通过如下方法制备混合限定剂量的至少一种根据本发明使用的物质组合与限定剂量的药用合适的和生理学相容的载体和任选的其它合适的活性物质、添加剂或助剂，并将其加工成期望的剂型。聚乙二醇、水和缓冲溶液可被考虑作为稀释剂。合适的缓冲物质为例如N，N’- 二苄基亚乙基二胺、 二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、N-苄基苯乙胺、二乙胺、磷酸盐、碳酸氢钠或碳酸钠。然而，也可以不采用稀释剂。生理学相容的盐为与无机酸或有机酸、或与无机碱或有机碱、或与氨基酸、或与无机盐形成的盐，所述无机酸或有机酸为例如乳酸、盐酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、对甲苯磺酸，所述无机碱或有机碱为例如Na0H、K0H、Mg(0H)2、二乙醇胺、乙二胺，所述氨基酸为比如精氨酸、赖氨酸、谷氨酸等，所述无机盐为比如CaCl2、NaCl或其游离离子，比如 Ca2+、Na+、Cl—、S042—或Mg++或Mn++的相应盐和游离离子、或其组合。它们是根据标准方法制备的。优选地，PH为5至9，尤其是6至8。本发明的一个变型方案很重要，该变型方案包括L-核酶用于制备用于治疗或预防与至少一种内源基因过表达有关的疾病的药物组合物的用途，其中所述L-核酶能够切割编码该基因的内源靶D-RNA的靶序列。在其它方面，上述描述类似地适用。在这一点上， 在本发明的上述方面的另一个变型方案是重要的，其为L-核酶用于制备用于治疗或预防与哺乳动物感染微生物有关的疾病的用途，其中所述L-核酶能够切割编码该微生物的基因的靶D-RNA的靶序列。作为可以考虑的微生物尤其提及病毒、细菌和真菌。原则上，所述核酶可用于切割具有至少部分已知基因序列的任意微生物，其中选择该基因序列区用于切割目的，其例如弱化或抑制微生物的活性和/或其复制能力和/或弱化或抑制其与细胞表面的结合。该变型方案利用了如下事实L-核酶也可以用于切割D-RNA，特别是mRNA或调节 RNA,例如但不限于siRNA、microRNA、shRNA、ncRNA、tRNA、rRNA等。通过这种方式，可以抑制基因或由其编码的蛋白质。对于所有与特定基因的过表达(与在没有患病的生物体中的表达相比)有关的疾病，这都是治疗上有用的。该变型方案具有的一个方面的益处是以非常高的特异性进行靶序列的切割，因而，也不会对调节系统有任何其它干涉。而且，可靠地防止了不良反应，比如与例如使用抑制性D-核苷酸比如siRNA有关的。如下参照附图和实施例，更详细地阐述本发明。所述附图显示图1:在结合至靶序列之前(a)和之后(b)的最小锤头状核酶， 图2 一方面L-靶与D-核酶的反应与MgCl2浓度关系，和另一方面D-靶与L-核酶的反应与MgCl2浓度关系的比较分析，
图3:在IOmM的MgCl2下，一方面L-靶与D-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与L-核酶反应与时间的关系的比较分析，
图4:在10倍的L-核酶过量情况下，一方面L-靶与L-核酶的反应与MgCl2浓度 (l-25mM)的关系，和另一方面D-靶与D-核酶的反应与MgCl2浓度(l-25mM)的关系的比较分析，
图5:在10倍的L-核酶过量情况下，一方面L-靶与L-核酶的反应与MgCl2浓度 (0. I-ImM)的关系，和另一方面D-靶与D-核酶的反应与MgCl2浓度(0. I-ImM)的关系的比较分析，
图6 在IOmM的MgCl2和10倍的L-核酶过量情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶与时间的关系的比较分析，
图7:在0. ImM的MgCl2和10倍的L-核酶过量情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶反应与时间的关系的比较分析，
图8:在ImM的MgCl2和1倍的L-核酶过量情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶反应与时间的关系的比较分析，
图 9 在 0. ImM 的 MgCl2 和 10 倍的 L-核酶欠量(10-fachem L-Ribozym-Unterschuss) 情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶反应与时间的关系的比较分析，
图10:在ImM的MgCl2和10倍的L-核酶欠量情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶反应与时间的关系的比较分析，
图11 在5mM的MgCl2和10倍的L-核酶欠量情况下，一方面L-靶与L-核酶反应与时间的关系，和另一方面D-靶与D-核酶反应与时间的关系的比较分析，和图12:在人血清中，L-核酶切割L-靶的试验。实施例1 切割试验
在各种条件下，测量L-核酶和D-核酶的活性。基本条件如下在0. 002 μ Μ、0. 02 μ M禾口 2 μ M核酶的存在下，在50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 7. 5，在20°C下，用10 μ 1的反应混合物培养0. 02 μ M的靶RNA 2小时(因此，核酶/靶的比例为10 1、1 1和1 10)。在反应之前，在70°C下，使靶RNA和核酶变性2分钟，并在加热模块中慢慢地冷却(1°C /min)至25°C。 研究浓度为0. 1至25mM的Mg2+离子的影响。在0. 09 M Tris-硼酸盐缓冲液，pH 8. 3中， 在8 M脲的存在下，用20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离切割产物。在Wiosphoimager Fuji Film FLA 5100上分析荧光度。用程序Fuji Analysis Program得到数据。用Excel制图。实施例2 靶序列和核酶的制备
通过 ChemGenes Corporation, Wilmington, USA 公司的定制合成 (Auftragssynthese)制备下述靶序列 Seq-ID 1: 5'-FAM-ACA⑶CGOTCGCd (RNA,同时含有D-核苷酸和L-核苷酸)，和 Seq-ID 2: 5' -FAM-ACAGTCGGTCGCC-3‘(DNA,同时含有D-核苷酸和L-核苷酸)。合成产物具有高于90%的纯度。作为核酶序列，根据靶序列，锤头状核酶的可变区选自三联体GUC，随后的核酶序列由 ChemGenes Corporation, Wilmington, USA 公司制备
Seq-ID 3: 5‘-FAM-GGCGACCCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAACU⑶_3‘ (RNA,同时含有D-核苷酸和L-核苷酸)。合成产物具有高于85%的纯度。用荧光素在5’ -末端标记所有合成产物。实施例3 L-核酸与D-核酸的相互作用
图2显示L-核酶切割D-靶与浓度的关系，以及反过来。C为对照(L-靶+L-核酶)， 第1至5个足迹为在没有核酶情况下对于靶在图中给出的各种MgCl2浓度(0-25mM)，第6 至9道足迹为具有2 μ M核酶的0. 2 μ M的靶。可以看出尽管D-核酶没有切割L-靶，但是在反过来的情况必然出现明显的反应。 这意味着例如由L-核苷酸组成的镜像适配体除了其作为特定3-D结构的特异性适体的作用之外，与现有的观念相反，其可能会参与其它生理学相互作用，例如作为核酶。因此，当给药至生物体时，镜像适配体具有不合意的副作用的危险。然而，还得出L-核酶可用于切割内源D-RNA，由此导致D-RNA (例如mRNA)编码的基因或蛋白质的治疗上力争取得的抑制。图3显示L-核酶对D-靶的切割产物的份额随时间增加，并且总是显著地高于 L-靶的切割产物的份额(C足迹对照，如上，第1至10道足迹，所述图的时间0至256分钟)。实施例4 =L-核酶对L-靶的切割
从图4至11可以看出，在所有的常见条件下，L-核酶有效地切割具有相应靶序列的 L-靶，而且，具有的转化率至少相当于D核酶连同D-靶的那些。图12证实L-核酶对L-靶的切割在人血清的条件下也有效地进行。
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权利要求
1.L-核酶用于制备药物组合物的用途。
2.权利要求1所述的用途，其中所述L-核酶能够在L-RNA的靶序列区切割L-RNA。
3.L-核酶用于制备用以治疗由于给药包含L-RNA的治疗分子引起的不合意的生理学不良反应的药物组合物的用途，所述L-核酶能够在L-RNA的靶序列区切割L-RNA。
4.L-核酶用于制备用于治疗或预防与至少一种内源基因过表达有关的疾病的药物组合物的用途，其中所述L-核酶能够切割编码该基因的内源靶D-RNA的靶序列。
5.权利要求3所述的用途，特征在于所述治疗分子由L-RNA组成，特别地为双链 L-RNA，例如镜像适配体。
6.权利要求3所述的用途，特征在于所述治疗分子包含与L-RNA共价结合的适体或与其共价结合的抗体。
7.权利要求3和5至6中任一项所述的用途，其中所述药物组合物包含至少剂量相当于L-RNA给药剂量的L-核酶，优选地包含剂量相当于L-RNA给药剂量2至100倍、优选2 至20倍的L-核酶。
8.权利要求3至7中任一项所述的用途，特征在于所述L-核酶为锤头状核酶。
9.权利要求3至8中任一项所述的用途，特征在于所述药物组合物还包含核酸，特别是 5-至20-聚体，其能够在靶序列区融合双链D-RNA或L-RNA。
10.包含L-核酶的药物组合物，其用于治疗由于给药包含L-RNA的治疗分子引起的不合意的生理学不良反应。
11.包含L-核酶的药物组合物，用于治疗或预防与至少一种内源基因过表达有关的疾病，其中所述L-核酶能够切割编码该基因的内源靶D-RNA的靶序列。
12.用于制备权利要求10或11所述的药物组合物的方法，其中制备并合成L-核苷酸序列，该序列能够切割给定L-核糖核苷酸的序列或给定D-核糖核苷酸的序列，并且其中所述L-核酶以给药用的药理学有效剂量制备。
13.权利要求12所述的方法，其中将所述L-核酶与盖仑助剂和/或载体混合。
全文摘要
本发明涉及L-核酶用于制备用以治疗由于给药包含L-RNA的治疗分子而引起的不合意的生理学不良反应的药物组合物，其中L-核酶能够切割L-RNA的靶序列区的L-RNA。备选地，借助该L-核酶能够切割内源目标RNA。
文档编号A61K38/00GK102405054SQ201080014607
公开日2012年4月4日 申请日期2010年2月8日 优先权日2009年2月6日
发明者怀茨科 E., 埃尔德曼 V. 申请人:柏林自由大学