一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物抗体检测技术领域，涉及一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体 的ELISA方法。
【背景技术】
[0002] 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，C. perfringens)是一种重要的人畜共 患病病原体，广泛分布于自然界，导致多种动物发生坏死性肠炎（Necrotic enteritis，NE) 和肠毒血症以及人类的气性坏疽和食物中毒。产气荚膜梭菌分泌的多种毒素在其引发的疾 病中具有重要作用。
[0003] 近二十年来，α毒素被认定是养禽业坏死性肠炎的主要致病因素，A型 C. perfringens的培养上清能够使肉鸡出现坏死性病变，而且抗α毒素抗体具有保护作 用。但近期关于NetB毒素 （Necrotic enteritis B-Iike toxin)的研宄对该病的致病机 制又增加了新的解释。NetB毒素是首次在NE病鸡体内分离的A型C. perfringens中发现 的。从鸡坏死性肠炎患病动物体内分离的大量菌株携带NetB基因，动物疾病模型出现的大 体病变与临床报道的坏死性肠炎病变相同。因此，认为NetB在禽类坏死性肠炎的发病机制 中可能是一种关键和重要的致病毒力因子。阻断ELISA方法来检测产气荚膜梭菌血清中是 否含有NetB毒素是至关重要的。因此NetB毒素的检测对产气荚膜梭菌病的诊断具有重要 意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，用 于NetB毒素的早期检测，为产气荚膜梭菌的早期诊断和综合防治及后续科学研宄提供有 效检测工具。此方法只需要少量的血清样品，对于疾病的检测更加便捷。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] -种检测产气荚膜梭菌NetB毒素抗体的阻断ELISA方法，包括如下步骤：
[0007] 一、阻断ELISA检测方法的建立
[0008] (1)用包被液将产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白稀释至5 μ g/mL，100 μ L/孔包被 96孔酶标板，4 °C过夜；
[0009] (2) PBST溶液洗涤3次，加入用PBS溶液稀释的1 % BSA作为封闭液200 μ L/孔， 37°C孵育 2h ;
[0010] ⑶PBST溶液洗涤3次后加入待检样品，同时设置阴性和阳性对照，阳性对照为 NetB毒素多克隆抗体，阴性对照为阴性血清，100 μ L/孔，37°C孵育I. 5h ;
[0011] (4) 3次PBST溶液洗涤后，将抗产气荚膜梭菌NetB毒素的F9G3单克隆抗体用PBS 缓冲液稀释至〇. 635 μ g/mL，100 μ L/孔，37°C反应Ih ;
[0012] (5) PBST溶液洗涤3次，加入用PBS缓冲液I : 5000体积比稀释的HRP标记的羊 抗鼠 IgG抗体，37°C孵育lh，PBST溶液洗涤3次；
[0013] (6)最后加入显色液100 μ L/孔，室温条件避光反应lOmin，用2M &504溶液终止 反应，490?处读取吸光值。
[0014] 二、结果判定标准的确定
[0015] 计算CP阴性样品平均值（I)与标准差（S)，求得（I )+3( S )为阳性临界值， (1)+2(3)为阴性临界值；当样品阻断率 ？12:(；0+3(3)，则血清样品判为阳性；当 PI沒i )+2( S )时为阴性；对于在介于两者之间的血清样品，判定为可疑，需要重复检测一 次，如仍可疑则判定为阳性。
[0016] 本发明中，所述包被液为0. 05mol/L碳酸盐包被缓冲液，其配制方法如下：称取 Na2CO3 1.5g、NaHC03 2.93g，调节 pH 至 9.6，加蒸馏水至100〇11^，4°〇保存。
[0017] 本发明中，所述PBST溶液为含0. 05% Tween-20的PBS溶液，其配制方法为：称取 NaCl 8g，KCl 0· 2g，Na2HPO4 · 12H20 3. 58g，KH2PO4 0· 27g，加蒸馏水至 lOOOmL，调至 ρΗ7· 4 ; 再加入 〇· 5mL Tween-20 〇
[0018] 本发明中，所述封闭液为PBS溶液稀释的I % BSA，配制方法为：每100ml PBS溶液 中加 Ig BSA。
[0019] 本发明具有如下优点：
[0020] 1、本发明在利用单克隆抗体的基础上建立了一种快速、敏感、特异的阻断ELISA 方法来检测产气荚膜梭菌血清中的NetB毒素特异性抗体。
[0021] 2、本方法有望成为临床产气荚膜梭菌病的快速诊断及免疫检测的重要工具，在产 气荚膜梭菌疾病的诊断和防治中发挥重要作用，具有很好的应用价值。
[0022] 3、本发明确定了最佳抗原的包被量、抗体的稀释度、抗原的包被时间、最佳封闭液 和封闭时间、最佳样品孵育时间、最佳单抗的孵育时间、酶标抗体的浓度和作用时间、最佳 显色时间等条件。通过阴性样品确定了临界值，最低抗原检出量确定了其灵敏性，特异性试 验确定了其特异性良好，批内批间试验确定该方法的重复性良好。
[0023] 4、本发明只需要少量的血清样品，应用建立的NetB毒素阻断ELISA检测方法可以 对疾病进行更加便捷的检测。
[0024] 5、本发明操作简单、检测速度快、可定量检测和大批量检测。
【附图说明】
[0025] 图1是产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白表达，1 :空载体，2 :marker，3 :0小时对 照，4 :1小时，5 :2小时，6 :3小时，7 :4小时，8 :5小时，9 :上清，10 :沉淀；
[0026] 图2是F9G3株单克隆抗体腹水纯化，0 :纯化前，1 :纯化后，2 !Marker ;
[0027] 图3是三因素法确定的最佳蛋白、多抗和单抗浓度；
[0028] 图4是抗原包被时间的选择；
[0029] 图5是最佳封闭液的选择；
[0030] 图6是最佳封闭时间的选择；
[0031] 图7是最佳待检样品孵育时间的选择；
[0032] 图8是最佳单抗孵育时间的选择；
[0033] 图9是最佳酶标抗体稀释浓度的选择；
[0034] 图10是最佳酶标抗体孵育时间的选择；
[0035] 图11是最佳显色液作用时间的选择；
[0036] 图12是阻断ELISA特异性试验。
【具体实施方式】
[0037] 下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本 发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖 在本发明的保护范围中。
[0038] 实施例1
[0039] 产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白的诱导表达：
[0040] 将PCR鉴定pGEX-NetB阳性的重组表达菌按1 : 100 (v/v)接种于20mLAmp+LB液 体培养基中，于37°C振荡培养2-3h。当培养物的0D_值达0. 4-0. 6时，取出ImL菌液作为 诱导前（Oh)对照，置于4°C暂时保存。向剩余菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为lmmol/L， 继续培养。每隔Ih (即诱导后第1、2、3、4和5h)取出ImL菌液。将各小时菌液进行1000 Or/ min离心5min收集细菌沉淀，加入20 μ L PBS悬起沉淀后加入等量2 X SDS上样缓冲液（含 200mmol/L DTT)混匀，煮沸10min，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)分析重组蛋白的 表达情况。根据预测的重组蛋白分子量大小选择使用浓度为12 %的分离胶和5 %的压缩胶 进行SDS-PAGE分析（见图1)，经切胶纯化复性制备的NetB毒素重组蛋白（见图2);蛋白 质印迹法（Western-blot)验证纯化后的NetB毒素重组蛋白的纯度和免疫原性，用于后续 动物免疫实验和检测实验。
[0041] 实施例2
[0042] 抗产气荚膜梭菌NetB毒素多克隆抗体的制备：
[0043] 选取2_3Kg新西兰大白兔，首免为纯化的NetB毒素重组蛋白与等体积弗式完全佐 剂完全乳化后背部皮下多点注射，剂量为2mg/只，首免2周后用弗式不完全佐剂与等体积 纯化的NetB毒素重组蛋白完全乳化，剂量为Img/只，每周免疫1次，3免后1周用不加佐剂 的纯化的NetB毒素重组蛋白加强免疫1次，7d后兔心脏采血获得血清，得到抗产气荚膜梭 菌NetB毒素多克隆抗体，通过间接ELISA法检测抗体效价，蛋白质印迹法用于多抗特性鉴 定。
[0044] 实施例3
[0045] 抗产气荚膜梭菌NetB毒素单克隆抗体的制备：
[0046] a、产气荚膜梭菌NetB毒素重组蛋白免疫BALB/c小鼠
[0047] 选择与骨髓瘤细胞SP2/0同源的纯系雌性BALB/c小鼠作为免疫动物，以纯化和复 性后的NetB毒素重组蛋白为免疫抗原，首次免疫时取50 μ g纯化蛋白与等体积完全弗氏佐 剂进行乳化，采用腹腔注射方式对6周龄雌性BALB/c小鼠进行免疫；3周后取50 μ g纯化 蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化进行第二次免疫；此后每隔2周进行一次免疫，免疫剂 量和免疫途径与第二次免疫相同，最后一次免疫后3-