识别维罗毒素Ⅱ的人源化抗体和产生它的细胞系的制作方法

专利名称：识别维罗毒素Ⅱ的人源化抗体和产生它的细胞系的制作方法
相关申请的交叉参考本申请要求1998年5月20日提交的USSN60/086,570的优先权，为此目的其全文被引入作为参考。
存在两种类型的维罗毒素(或志贺样毒素)，即维罗毒素Ⅰ(VT1或SLT-1)和维罗毒素Ⅱ(VT2或SLT-2)。(参见O’Brien等，现代微生物免疫学总论，2180,65-94(1992))。已从患有VTEC感染的患者中分离产生VT2的大肠杆菌。(参见Russmann等，医学微生物学杂志,40(5),338-343(1994))。Ostroff等，传染病杂志160994-998(1989)和Kleanthous等儿童主要疾病65,772-727(1990)报道包含VT2但不包含VT1的大肠杆菌0157菌株更经常与HUS相关。存在其他在临床上也被分离的VT2变异体。(参见例如微生物病原体，8,47-60(1990)；FEBSLett.,79,27-30(1991)；微生物病原体，5,419-426(1988)；和微生物学杂志，170,4223-4230(1988))。Armstong等传染病杂志，171(4),1042-1045(1995)，在临床试验中测试了一个VT吸收剂，然而，此药物仅在肠中起作用，不能吸收到达血液中的VT。与对VT1比较，γ-球蛋白制剂对VT2显示极低的中和活性(Ashkenazi,S.等儿科学杂志，113,1008-1014(1988)；Morooka,T.等ActaPaediatricaJaponica,38,294-295(1996))。报道了中和VT2的小鼠单克隆抗体。然而，该抗体被报道显示相对低的VT2V结合亲和性(Schmitt,C.等传染和免疫，59,1065-1073(1991))。
而且，如上面描述的那些小鼠单克隆抗体的用途在人治疗中具有一些缺陷，尤其是在如下描述的重复治疗方案中。例如，小鼠单克隆抗体在人中往往具有短的半衰期，并且当用于人中时缺乏其他重要免疫球蛋白功能性特征。
此外，小鼠单克隆抗体本质上包含当注射至患者中时为免疫原性的氨基酸序列。许多研究表明在注射外源抗体后，由针对注射抗体由患者引发的免疫反应可相当强，在初始治疗后，基本上消除抗体的治疗用途。而且，如果小鼠或其他抗原性(对人)单克隆抗体被用来治疗各种人疾病，由于交叉反应，随后的用不相关的小鼠单克隆抗体的治疗可能无效或甚至对他们自身有害。
虽然所谓“嵌合抗体”的产生(例如小鼠的可变区与人恒定区相连)已在一定程度上被证实是成功的，仍存在明显的免疫原性问题。通常，使用典型的人单克隆抗体制备技术制备与如许多抗原一样，高亲和性地与VT2抗原反应的人免疫球蛋白是极其困难的。
因此，需要改进形式的特异于VT2抗原，对人基本上为非免疫原性，并且以适宜于治疗制剂和其他用途的方式容易并经济地制备的人免疫球蛋白。本发明满足这些和其他需要。
一些人源化抗体为小鼠抗体VTm1-1的人源化形式，其中小鼠抗体特征在于示于

图1B的轻链可变区和示于图1A的重链可变区。
本发明进一步提供与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性结合VT2和/或VT2变异体的抗体。
如上所述，一些人源化抗体包含来自小鼠VTm1-1抗体的互补决定区和来自人GF4抗体重链和轻链框架的重链和轻链可变区框架，前提是选自L49,H29,H30,H49和H98的至少一个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。这些人源化抗体以107M-1至小鼠VTm1-1抗体亲和性的3,5或10倍的亲和常数特异性地与维罗毒素Ⅱ结合。
在前面段落描述的一些人源化抗体中，选自L49,H29,H30,H49和H98的各个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。
在一些上面的人源化抗体中，选自L3,L4,L19,L76,L79,L85,H1,H4,H5,H79,H89和H93的至少一个位置被存在于人抗体重链或轻链共有序列的相同位置的氨基酸占据。在一些人源化抗体中，选自L3,L4,L19,L76,L79,L85,H1,H4,H5,H79,H89和H93的各个位置被存在于人抗体重链或轻链共有序列的相同位置的氨基酸占据。
一些人源化抗体包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区，前提是选自L49,H29,H30,H49和H98,L3,L4,L19,L76,L79,L85,H1,H4,H5,H79,H89和H93的一个或多个位置可被如表2和3所示取代。
一些人源化抗体包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区。
一些人源化抗体包含与图2A所示人源化重链具有至少85％相同性的人源化重链和与图2B所示人源化轻链具有至少85％相同性的人源化轻链，前提是选自L49,H29,H30,H49和H98的至少一个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。
如上所述的一些人源化抗体包含两对轻链/重链二聚体，其中每一条链包含一个可变区和一个恒定区。
如上所述的一些人源化抗体为Fab片段或F(ab’)2。任选地，如上所述，人源化抗体以纯化的形式提供。如上所述，一些人源化抗体具有IgG1免疫球蛋白同型。
本发明进一步提供制备人源化VTm1-1抗体的方法。该方法包括培养编码上述任一抗体的重链和轻链的细胞系，从而表达人源化抗体；回收细胞系表达的人源化抗体。其中一些方法进一步包括将抗体与药物学可接受载体混合以制备药物组合物。
本发明进一步提供包含上述任一抗体和药物学可接受载体的药物组合物。优选的组合物包括包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区的人源化抗体。本发明进一步提供上述任一抗体在制备用于治疗患有或处于维罗毒素毒性作用危险中的患者的药物中的应用。
本发明进一步提供治疗患有或处于维罗毒素毒性作用危险中的患者的方法，包括给患者施用与维罗毒素Ⅱ和/或维罗毒素Ⅱ变异体特异性结合的有效量的人或人源化抗体。在其中一些方法中，抗体与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性地与维罗毒素Ⅱ或维罗毒素Ⅱ变异体结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体的B亚基结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体结合并中和VT2和/或VT2变异体。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2的B亚基和/或VT2变异体的B亚基结合并中和VT2和/或VT2变异体。在其中一些方法中，抗体为人源化抗体，其为小鼠VTm1-1抗体的人源化形式。在其中一些方法中，抗体为包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区的人源化抗体。在其中一些方法中，患者为被产维罗毒素大肠杆菌感染并治疗性地施用抗体。在其中一些方法中，患者为处于被产维罗毒素大肠杆菌感染的危险中并预防性地施用抗体。其中一些方法进一步包括监测患者对维罗毒素Ⅱ或维罗毒素Ⅱ变异体的毒性作用的恢复。在另一个方面，本发明提供产生上述任一抗体的细胞系。
本发明提供新的可用于例如治疗产生维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)的组合物，该组合物包含能特异性地与VT2抗原的B亚基结合并中和VT2和VT2的变异体的人源化免疫球蛋白。免疫球蛋白可具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含一个或多个功能性地与人框架区片段相连的小鼠互补决定区。例如，带有或不带有其他天然相关的小鼠氨基酸残基的小鼠的互补决定区可被导入人框架区以产生能以大于107M-1的亲和水平与抗原结合的人源化免疫球蛋白。这些人源化免疫球蛋白也能阻断提供CDR的小鼠单克隆抗体与VT2的结合。
本发明的免疫球蛋白，包括结合片段和它的其他衍生物可容易地通过各种重组DNA方法制备，并在转染的细胞中最后表达，优选无限增殖的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞。包含编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和编码所需免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸可合成制备或通过重组适宜的cDNA和基因组DNA片段制备。
在治疗来自如在产生维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)期间产生的VT2或VT2V的可能的毒性后果中，可使用基本上纯的形式的人源化免疫球蛋白。人源化免疫蛋白或它们的复合物可以药物可接受的剂型制备，它随给药方式而变化。
图2人源化VTm1.1抗体(HuVTm1.1)的重链(A)和轻链(B)可变区的cDNA和翻译的氨基酸序列。互补决定区(CDRs)被下划线，成熟链的第一个氨基酸被双划线。
图3合成人源化抗体可变区cDNA的方案。
图4MuVTm1.1和HuVTm1.1抗体与大肠杆菌维罗毒素Ⅱ(VT2)的竞争性结合。在生物素化的示踪物MuVTm1.1存在下，将增加浓度的竞争抗体与包被的TV2一起培养。测定吸光率并对未标记的竞争抗体的浓度作图。
图5与MuVTm1.1比较，HuVTm1.1的体外中和活性。
图6HuVTm1.1被识别抗原(VT2的B亚基)的确定。
图7MuVTm1.1对VT2和VT2变异体的中和活性。
定义术语“基本上相同”，在两个核酸或多肽(例如编码人源化免疫球蛋白的DNA或人源化免疫球蛋白的氨基酸序列)中指当比较和排列最大对应性时，如使用下面的序列比较方法和/或通过肉眼观察所测定的，具有至少约80％，最优选85％，90-95％或更高的核苷酸或氨基酸残基相同性的两个或多个序列或亚序列。这些“基本上相同的”序列通常被认为同源。优选地，“基本上相同”存在于长度为约至少50残基的区域相同，较优选至少约100个残基的区域，最优选序列至少150个残基基本相同，或比较的两个序列的全长相同。如下所述，通过使用Kabat的计数系统，任何两个抗体序列可仅用一种方式比较。因此，对于抗体，相同的百分率具有唯一并确切定义的含义。
来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸序列被分别称为Hx和Lx，其中根据Kabat方法，SequenceofImmunologicalInterest(国家健康协会,BethesdaMD,1987和1991),x为表示氨基酸位置的序号。Kabat列出了各个亚组抗体的许多氨基酸序列，并列出了亚组中各个残基位置最常出现的氨基酸以产生共有序列。Kabat使用用于定位所列序列中各个氨基酸的残基序号的方法，该定位残基序号的方法在本领域已成为标准方法。通过参考保守氨基酸，将讨论的抗体与Kabat的共有序列比较，Kabat的方法可延伸至未包括在其总结中的其他抗体。例如，人抗体的L50位置的氨基酸占据了与小鼠抗体的位置L50的氨基酸相同的位置。
保守氨基酸取代指具有类似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为颉氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-颉氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可使用如Cesareni,FEBSLett307:66-70(1992)；Swimmer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3756-60(1992)；Gram等Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3576-80(1992)；Clackson等，自然,352:624-8(1991)；Scott和Smith,科学249:386-90(1990)；Garrard等，生物/技术9:1373-1377(1991)所描述的噬菌体展示法筛选作为例证的抗体序列的类似物结合活性的保留，其中上述参考文献为此目的全文被引入作为参考。
术语“基本上纯的”指目的物为存在的主要物质(即以摩尔为基础，在组合物中它比任何其他各物质量更大)，优选基本上纯化的组合物为目的物包含存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔为基础)的组合物。通常，基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子物质的约80-90％。最优选地，目的物被纯化至本质上均一(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物)，其中组合物本质上由单一大分子物质细成。
抗体之间的竞争通过这样一种分析法检测，即待测的免疫球蛋白抑制参考抗体与抗原决定簇的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合分析法，例如固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA)、夹层竞争分析法(参见Stahli等酶学方法9:242-253(1983)；固相直接生物素-抗生物素EIA(参见Kirkland等免疫学杂志137:3614-3619(1986))；固相直接标记分析法，固相直接标记夹层分析法(参见Harlow和Lane，“抗体，实验室手册”冷泉港出版(1988)；使用Ⅰ-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等，分子免疫学25(1):7-15(1988)；固相直接生物素-抗生物素EIA(Cheung等病毒学176:546-552(1990)；和直接标记RIA(Moldenhauer等Scand.免疫学杂志32:77-82(1990))。通常检测的免疫球蛋白过量存在。通过竞争分析法确定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体相同表位结合的抗体和与邻近表位结合的抗体，其中该邻近的表位与被参考抗体结合以发生空间位阻的表位足够靠近。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制至少50％或75％的参考抗体与指定的抗原靶的特异性结合。发明详细描述根据本发明，提供特异性地与VT2的B亚基反应的人源化免疫球蛋白。这些与VT2的B亚基具有至少约10-M-1-10101M-1，优选106M-1-10101M-1或更高的结合亲和性的免疫球蛋白能例如中和VT2和VT2V(VT2抗原)的毒性。人源化的免疫球蛋白具有人框架并具有一个或多个与VT2抗原特异性反应的来自免疫球蛋白，通常为来自小鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR’s)。在一个优选的具体实施方案中，一个或多个CDR来自MuVTm1.1抗体。因此，可大量经济地制备的本发明的免疫球蛋白在例如通过各种技术在患者中治疗来自产维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)的毒性后果中找到了应用。
已知基本的抗体结构单元包含四聚体。每一个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。各个链的氨基末端包括一个主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。各个链的羧基末端部分决定主要负责效应子功能的恒定区。
轻链被分为kappa或λ。重链被分为γ、mu、α、δ或ε，定义抗体的同型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过“J”区和约12个或更多的氨基酸相连，重链还包括“D”区或约10或更多的氨基酸(通常参见基础免疫学Paul,W.,编，第7章，131-166,RavenPress,N.Y.(1984)，其被本文引作参考)。
各个轻链/重链对的可变区形成了抗体结合位点。所有链均显示通过三个高变区相连的相对保守框架区相同的一般性结构，也称为互补决定区或CDR’s(参见“感兴趣的免疫蛋白的序列”Kabat,E.,等美国健康和人类保障系，(1987)；和Chothia和Lesk分子生物学杂志，196,901-917(1987)，其被本文引作参考)。来自每对两个链的CDR’s通过框架区排列，使得能与特定的表位结合。
如本文所采用的，术语“免疫球蛋白”指由一个或多个本质上由免疫蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。已知的免疫球蛋白的基因包括kappa、λ、α、γ、δ、ε和mu恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以除抗体之外的各种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab’)以及双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等欧洲免疫学杂志17,105(1987))和存在于单链中(例如Huston等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,5879-5883(1988)和Bird等科学242,423-426(1988)，其被本文引作参考)。(通常参见Hood等免疫学，Benjamin,N.Y.,第二版编(1984),Harlow和Lane，抗体实验室手册，冷泉港实验室(1988)和Hunkapiller和Hood，自然，323,15-16(1986)，其被本文引作参考)。
嵌合抗体为通常通过遗传工程的方法从属于不同种的免疫球蛋白基因片段构建其轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区(V)片段可与人恒定区(C)片段，如γ1和γ3相连。因此，典型的治疗性嵌合抗体为由V或来自小鼠抗体的抗原结合区和C或来自人抗体的效应子区组成的杂交蛋白，虽然可使用其它哺乳动物种类。
如本文所采用，如Kabat等在所引用的书中所定义的，术语“框架区”指单一种中不同的免疫球蛋白中相对保守的(即不是CDR’s)免疫球蛋白轻链的重链可变区的那些部分。如本文所采用的，“人框架区”为与天然产生的人抗体的框架区基本相同(大约85％或更多)的框架区。
如本文所采用的，术语“人源化免疫球蛋白”指包含人框架，至少一个来自非人抗体以及其中存在的任一恒定区基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85-90％，优选至少95％相同的的CDR的免疫球蛋白。因此，除开可能的CDR’s，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的对应部分相同。例如，人源化免疫球蛋白不包括嵌合的小鼠可变区/人恒定区抗体。
人源化抗体在用于人类治疗中比小鼠和一些情况下的嵌合抗体具有至少三个可能的优点由于效应子部分为人的，它可更好地与人免疫系统的其它部分相互作用(例如通过补体依赖细胞毒性(CDC)或抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)更有效地摧毁靶细胞)。
人免疫系统不将人源化抗体的框架或C区识别为外源性的，因此针对该注射抗体的抗体反应应比针对整个外源小鼠抗体或部分外源嵌合抗体小。
已报道注射的小鼠抗体在人体循环中具有正常抗体的半衰期更短的半衰期(Shaw,D.等免疫学杂志，138,4534-4538(1987))。推测注射的人源化抗体具有基本上与天然产生的人抗体相同的半衰期，这使得可施用更小和更少频率的剂量。
在一个方面，本发明涉及编码来自能结合VT2的B亚基的免疫球蛋白，如单克隆抗体MuVTm1.1的重链和/或轻链CDR’s的重组多核苷酸。编码这些区域的多核苷酸通常与编码适宜人框架区的多核苷酸相连。对于人框架区，将提供CDR的非人免疫球蛋白的框架或可变区氨基酸序列与人免疫球蛋白序列组中的对应序列比较，选择具有高同源性的序列。在表达上编码包含单克隆抗体MuVTm1.1的重链和轻链CDR’s的多肽链的作为实例的多核苷酸包括在图1中。如下所述，由于密码子的简并性和非关键氨基酸的取代，其它多核苷酸序列可容易地替代那些序列。可如下进行人源化免疫球蛋白的设计。当一个氨基酸归于下面的分类中时，使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸被来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸代替受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸在该位置对于人免疫球蛋白是不常见的，而受体免疫蛋白中的对应氨基酸在该位置对于人免疫球蛋白是常见的；氨基酸的位置紧邻一个CDR’s；或在免疫球蛋白的三极结构模型中，CDR的一个氨基酸为约3(分别参见Queen等，在所引用的书中和Co等Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,2869(1991)，其均被本文引作参考)。
当受体免疫球蛋白的人框架区中的各个氨基酸和受体免疫球蛋白中的对应的氨基酸在该位置对于人是不常见的，该氨基酸在该位置被人免疫球蛋白常见的氨基酸代替。
对于人源化免疫球蛋白制备的详细描述参见Queen等所引用的书中和Co等所引用的书中。
多核苷酸通常进一步包括可操作性地与人免疫球蛋白编码序列相连的表达调控多核苷酸序列，包括天然相关或异源启动子区。优选地，表达调控序列为能转化或转染真核宿主细胞的载体的真核启动子系统，但也可使用用于原核宿主的调控序列。一旦载体被搀入适宜的宿主中，在适宜于核苷酸序列的高水平表达的条件下培养宿主，如果需要，可接着进行轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式收集和纯化。
能最终表达所需人源化抗体的本发明的核酸序列可从各种不同的多核苷酸(基因组或cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等)和各部分(例如V、J、D和C区)以及通过各种不同的技术形成。连接适宜的基因组和合成序列是目前最常用的制备方法，但也可使用cDNA序列(参见欧洲专利申请
发明者松本洋一, 今泉厚, 木村刚, 竹田多惠, 高万胜, 马克西米利亚诺·瓦斯克斯 申请人:帝人株式会社, 蛋白质设计实验室公司