专利名称：肠毒素c2全基因及其克隆和异源表达方法
技术领域：
本发明涉及肠毒素C2基因克隆和蛋白表达，具体说是金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)全基因及其制备和异源表达。
背景技术：
金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins，SEs)是一类细菌超抗原，它们无需抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APCs)的加工，也不受组织相容性复合体(MHC)的限制，在APC之外与T细胞受体Vβ链形成MHCII-SE-TCRVβ复合物，在1-10ng/ml浓度时，即能刺激大部分有TCRVβ序列的T细胞增殖，使之释放多种细胞因子，产生极强的免疫应答效应。研究发现，SEs可对肿瘤细胞产生超抗原依赖的细胞毒作用(Sag-dependent cell-mediated T-cell-derived cytotoxicity，SDCC)，从而产生系统的抗肿瘤反应。目前对肠毒素的克隆表达研究多集中于SEA和SEB，而对于有三个亚型的SEC族研究较少。三者的成熟蛋白氨基酸序列高度同源，SEC1和SEC3的基因序列已有报导，而SEC2的基因序列尚不清楚，SEC2的抗肿瘤作用已经应用于临床，并取得很好疗效。克隆并测定SEC2的全基因序列对研究C型肠毒素三亚型之间的关系和提高SEC2的肿瘤临床治疗效果具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)成熟蛋白的全基因及其制备和异源表达，利用本发明可使SEC2产量较原始生产菌株大大提高(约提高106倍)。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下肠毒素C2全基因，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
肠毒素C2全基因的克隆方法以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-F5’-GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’sec2-R5’-CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’通过PCR技术扩增出SEC2基因片段。
肠毒素C2全基因的异源表达方法将肠毒素C2全基因亚克隆至表达载体pET-28a中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建成异源表达SEC2蛋白的基因工程菌，在LB培养基中异源表达具有生物学活性的SEC2蛋白。
本发明具有如下优点1.本发明为人工构建的SEC2基因，首次获知基因全序列的组成。
2.本发明以SEC1和SEC3基因序列为基础，设计PCR引物，利用PCR技术，克隆SEC2全基因，并在大肠杆菌中表达，表达的SEC2经检验具有野生型的生物学活性；应用本发明，可提供直接用于生产SEC2蛋白的基因工程菌株。
3.本发明基因的异源表达提供了制备超抗原抗肿瘤生物制剂的一种新方法，具有产量高，生产稳定，方便纯化的特点。
图1为SEC2基因sec2的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，其中1为sec2的PCR扩增产物，2为DL2000DNA分子量标准；图2为pET-28a-sec2的双酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中1为DL15,000DNA分子量标准，2、3为pET-28a-sec2的双酶切结果，4为DL2000DNA分子量标准；图3为SEC2的大肠杆菌异源表达SDS-PAGE电泳图，其中1为诱导的pET28a空载体，2为蛋白分子量标准(由上至下分别为116，66，45，35，25，18，14KD)，3为诱导的SEC2的可溶性表达，4为诱导的SEC2的包涵体表达；图4为表达的SEC2蛋白的蛋白免疫印记检测图，其中1为SEC2蛋白的蛋白免疫印记检测结果，2为预染的蛋白分子量标准。
具体实施例方式
实施例1SEC2全基因的制备，具有SEQ ID NO1所示的序列001 G A G A G T C A A C C A G A C C C T A C G C C A G A T G A G T T G C A C A A A T C A A G T G A G T T051 T A C T G G T A C G A T G G G T A A T A T G A A A T A T T T A T A T G A T G A T C A T T A T G T A T101 C A G C A A C T A A A G T T A T G T C T G T A G A T A A A T T T T T G G C A C A T G A T T T A A T T151 T A T A A C A T T A G T G A T A A A A A A C T A A A A A A T T A T G A C A A A G T G A A A A C A G A201 G T T A T T A A A T G A A G A T T T A G C A A A G A A G T A C A A A G A T G A A G T A G T T G A T G251 T G T A T G G A T C A A A T T A C T A T G T A A A C T G C T A T T T T T C A T C C A A A G A T A A T301 G T A G G T A A A G T T A C A G G T G G T A A A A C T T G T A T G T A T G G A G G A A T A A C A A A351 A C A T G A A G G A A A C C A C T T T G A T A A T G G G A A C T T A C A A A A T G T A C T T A T A A401 G A G T T T A T G A A A A T A A A A G A A A C A C A A T T T C T T T T G A A G T G C A A A C T G A T451 A A G A A A A G T G T A A C A G C T C A A G A A C T A G A C A T A A A A G C T A G G A A T T T T T T501 A A T T A A T A A A A A A A A T T T G T A T G A G T T T A A C A G T T C A C C A T A T G A A A C A G551 G A T A T A T A A A A T T T A T T G A A A A T A A C G G C A A T A C T T T T T G G T A T G A T A T G601 A T G C C T G C A C C A G G C G A T A A G T T T G A C C A A T C T A A A T A T T T A A T G A T G T A651 C A A C G A C A A T A A A A C G G T T G A T T C T A A A A G T G T G A A G A T A G A A G T C C A C C701 T T A C A A C A A A G A A T G G A T A A(1)SEQ ID NO.1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度720碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型；cDNA(c)假设否
(d)反义否(e)最初来源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(2)SEC2全基因sec2的PCR扩增1)金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取接种金黄色葡萄球菌单菌落于5ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养，取1.5ml的培养物离心收集菌体。提取金黄色葡萄球菌基因组DNA(基因组DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。
2)PCR引物设计及反应条件根据基因sec1和sec3的DNA序列，设计一组引物正向引物sec2-F5’-GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’反向引物sec2-R5’-CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’PCR反应体系为10×Pyrobest buffer 5μl、dNTP 250μmol、0.02％BSA 2μl、上下游引物各25pmol、模板金黄色葡萄球菌基因组DNA 0.1μg、ExTaq DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μl。
PCR反应条件为第一阶段95℃，5分钟；第二阶段94℃，45秒；55℃，45秒；72℃，45秒；共30个循环；第三阶段72℃，10分钟；3)SEC2基因的鉴定PCR扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析并分离(参见附图1所示)，切下大小约为717bp的目的带，按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收；回收产物与pGEM-T克隆载体连接，构建成SEC2基因克隆载体pGEM-T-sec2，连接反应按Promega公司产品pGEM-T试剂盒使用说明书。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，(转化操作按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)，筛选阳性克隆并以Sanger双脱氧末端终止法测定DNA序列。
实施例2SEC2蛋白的表达1)SEC2蛋白表达载体的构建将pGEM-T-sec2质粒DNA以EcoRI、XhoI双酶切，胶回收试剂盒回收sec2片段。以T4DNA连接酶连接入经同样双酶切的pET-28a表达载体，构建成表达载体pET-28a-sec2，转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，提取质粒DNA，经EcoRI、XhoI双酶切鉴定正确重组克隆(参见附图2所示)。
2)SEC2蛋白的诱导表达接种转化了pET-28a-sec2质粒的BL21(DE3)单菌落于含40μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活化培养，以1％接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD600为0.6，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导表达6小时。离心收集菌体，以5×上样缓冲液处理(缓冲液配方和处理方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P81和P87)，12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色分析表达产物(参见附图3所示)。
实施例3SEC2蛋白的生物学活性以蛋白免疫印记法鉴定表达的SEC2蛋白的免疫原性将异源表达的SEC2蛋白以SDS-PAGE分离，半干转膜仪转至硝酸纤维膜，2％脱脂牛奶封闭，以兔抗SEC2抗体、碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体依次处理，NBT/BCIP显色试剂盒显色(参见附图4所示)。(所用缓冲液和具体操作方法按汪家政，范明《蛋白质技术手册》科学出版社2002第一版P166)。
肠毒素SEQUENCE LISTING<110>沈阳协合集团有限公司<120>肠毒素C2全基因及其克隆和异源表达方法<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>720<212>DNA<213>Staphylococcus aureus<220>
<221>CDS<222>(1)..(717)<223>
<400>1gag agt caa cca gac cct acg cca gat gag ttg cac aaa tca agt gag 48Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu1 5 10 15ttt act ggt acg atg ggt aat atg aaa tat tta tat gat gat cat tat 96Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr20 25 30gta tca gca act aaa gtt atg tct gta gat aaa ttt ttg gca cat gat 144Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp35 40 45tta att tat aac att agt gat aaa aaa cta aaa aat tat gac aaa gtg 192Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val50 55 60aaa aca gag tta tta aat gaa gat tta gca aag aag tac aaa gat gaa 240Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu65 70 75 80gta gtt gat gtg tat gga tca aat tac tat gta aac tgc tat ttt tca 288Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser85 90 95tcc aaa gat aat gta ggt aaa gtt aca ggt ggt aaa act tgt atg tat 336Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr100 105 110gga gga ata aca aaa cat gaa gga aac cac ttt gat aat ggg aac tta 384Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu115 120 125caa aat gta ctt ata aga gtt tat gaa aat aaa aga aac aca att tct 432
肠毒素Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser130 135 140ttt gaa gtg caa act gat aag aaa agt gta aca gct caa gaa cta gac480Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp145 150 155 160ata aaa gct agg aat ttt tta att aat aaa aaa aat ttg tat gag ttt528Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe165 170 175aac agt tca cca tat gaa aca gga tat ata aaa ttt att gaa aat aac576Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn180 185 190ggc aat act ttt tgg tat gat atg atg cct gca cea ggc gat aag ttt624Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe195 200 205gac caa tct aaa tat tta atg atg tac aac gac aat aaa acg gtt gat672Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp210 215 220tct aaa agt gtg aag ata gaa gtc cac ctt acaaca aag aat gga taa720Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly225 230 235<210>2<211>239<212>PRT<213>Staphylococcus aureus<400>2Glu Ser Gln Pro Asp Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Ser Ser Glu1 5 10 15Phe Thr Gly Thr Met Gly Asn Met Lys Tyr Leu Tyr Asp Asp His Tyr20 25 30Val Ser Ala Thr Lys Val Met Ser Val Asp Lys Phe Leu Ala His Asp35 40 45Leu Ile Tyr Asn Ile Ser Asp Lys Lys Leu Lys Asn Tyr Asp Lys Val50 55 60Lys Thr Glu Leu Leu Asn Glu Asp Leu Ala Lys Lys Tyr Lys Asp Glu65 70 75 80Val Val Asp Val Tyr Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Asn Cys Tyr Phe Ser85 90 95Ser Lys Asp Asn Val Gly Lys Val Thr Gly Gly Lys Thr Cys Met Tyr100 105 110Gly Gly Ile Thr Lys His Glu Gly Asn His Phe Asp Asn Gly Asn Leu115 120 125Gln Asn Val Leu Ile Arg Val Tyr Glu Asn Lys Arg Asn Thr Ile Ser130 135 140Phe Glu Val Gln Thr Asp Lys Lys Ser Val Thr Ala Gln Glu Leu Asp145 150 155 160
肠毒素Ile Lys Ala Arg Asn Phe Leu Ile Asn Lys Lys Asn Leu Tyr Glu Phe165 170 175Asn Ser Ser Pro Tyr Glu Thr Gly Tyr Ile Lys Phe Ile Glu Asn Asn180 185 190Gly Asn Thr Phe Trp Tyr Asp Met Met Pro Ala Pro Gly Asp Lys Phe195 200 205Asp Gln Ser Lys Tyr Leu Met Met Tyr Asn Asp Asn Lys Thr Val Asp210 215 220Ser Lys Ser Val Lys Ile Glu Val His Leu Thr Thr Lys Asn Gly225 230 23权利要求
1.肠毒素C2全基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
2.一种权利要求1所述肠毒素C2全基因的克隆方法，其特征在于以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板，采用引物sec2-F5’GAATTCGAG AGT CAA CCA GAC CCT A-3’sec2-R5’CTCGAGTTA TCC ATT CTT TGT TGT A-3’通过PCR技术扩增出SEC2基因片段。
3.一种权利要求1所述肠毒素C2全基因的异源表达方法，其特征在于肠毒素C2全基因以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主菌，构建成异源表达SEC2蛋白的基因工程菌，在培养基中异源表达有活性的SEC2蛋白。
全文摘要
本发明涉及基因重组和蛋白表达技术，具体地说是肠毒素C2全基因及其克隆和异源表达方法，肠毒素C2具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。本发明以SEC1和SEC3基因序列为基础，设计PCR引物，利用PCR技术，克隆SEC2全基因，并在大肠杆菌中表达，表达的SEC2经检验具有野生型的生物学活性。
文档编号C07H21/00GK1896241SQ20051004684
公开日2007年1月17日 申请日期2005年7月11日 优先权日2005年7月11日
发明者陈巨余, 徐明恺, 张成刚 申请人:沈阳协合集团有限公司