金黄色葡萄球菌肠毒素b的b细胞免疫优势表位肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制药领域，特别是涉及来自金黄色葡萄球菌肠毒素B的三个B细 胞免疫优势表位、鉴定此B细胞免疫优势表位的方法以及其在医药生物技术领域的应用。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus)，作为革兰氏阳性菌的代 表，是一类在自然界广泛存在的致病性球菌，也是引起医院感染和社区感染的一种重要致 病菌。调查研宄表明，在美国，社区皮肤及软组织感染最常见的病原菌为S. aureus(约占 75% );在日本，脓疱病中S. aureus引发的大疱性脓包病占的92% ;在非洲，热带脓性肌炎 病原体中S. aureus占55%~72%;在中国，感染性心内膜炎的头号致病菌为S. aureus (占 31%~34% )。此外，S. aureus感染以急性、化脓性为特征，局部可引起皮肤和软组织等的 化脓性感染，经久不愈；全身可导致骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、肺炎、脓毒血症等严 重感染及并发症，死亡率高达20%。同时，金葡菌的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤 综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。
[0003] 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，在含有血液和葡萄糖 的培养基中生长更佳，需氧或兼性厌氧。28°c~38°C均能生长，最适温度为37°C，pH为 4. 8~9. 4,最适为7. 4。耐盐性强，在含10%~15%氯化钠培养基中均能生长。在血脂平 板上形成的菌落较大，菌落周围形成明显的全透明溶血环（0 _溶血），溶血性菌株具有较 强致病性。按照噬菌体分型，金黄色葡萄球菌可分为5群26个型。噬菌体分型在流行病学 调查时追踪传染源及研宄菌型与疾病种类间的关系上均有重要意义。肠毒素型食物中毒由 III和IV群金黄色葡萄球菌引起，II群菌对抗生素产生耐药性的速度比I和IV群缓慢很多。 造成医院感染严重流行的是I群中的52、52A、80和81型菌株。引起疱瘆性和剥脱性皮炎 的菌株经常是II群71型。
[0004] 金黄色葡萄球菌耐热性肠毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE)，是引起人类 食物中毒、全身炎症反应和脓毒症休克的主要原因，也是金黄色葡萄球菌疫苗研宄最重要 的保护性抗原之一。SE因血清型差异SE分为SEA、SEB及SEC等多种型，每株临床MRSA分 离株可分泌1 _2种肠毒素，其中SEB，SEC及TSST-1最丰富。每株金黄色葡萄球菌能产生一 型或两型以上的肠毒素。近年发现，造成医院感染的耐甲氧西林金葡菌，80%以上产生肠毒 素 B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)。个别医院分离株几乎 100%产 SEB。
[0005] 金葡菌SEB属于超抗原，不需要抗原呈递细胞的加工处理，以完整的蛋白质分子 直接与在MHC II类分子的a #吉构域和TCR的0链V区结合，从而刺激T细胞活化增殖， 释放大量细胞因子如IL-2、IFN-Y及TNF-a。由金葡菌SEB引起的中毒性休克综合征的 病死率可达50 %，而与流感并发的金葡菌SEB感染其死亡率可达90 %以上，因此，气溶胶中 的金葡菌SEB是一种潜在的生化武器。当SEB进入机体后，其超抗原的结合引起单个核细 胞活化，导致广泛的细胞因子释放，而早期的TCR- a 0 T细胞释放的TNF- a对死亡的发生 起了重要的作用。
[0006] 经Blast比对证实，SEB在MRSA各菌株中序列保守，结构稳定。在小鼠模型中的研 宄证实，SEB具有比其他抗原更好的体液应答优势，合成的人SEB单克隆抗体可预防MRSA感 染常见的毒性休克综合症。但SEB本身为毒素，用于人体存在安全隐患，因此，失去毒性的 突变体SEB是MRSA疫苗较好的保护性抗原。目前，SEB突变体疫苗用于SEB中毒及抗MRSA 感染已在动物模型中获得成功。
[0007] 蛋白抗原发挥其功能主要通过表位来体现特异性。用SEB表位中的优势表位来制 备疫苗，有利于去除不利成份，增强免疫效果。因此，SEB抗原中免疫优势应答的保护性表 位的鉴定，是提升和优化基于SEB抗原的S. aureus疫苗设计的重要前提。筛选SEB的多个 免疫优势表位，将各抗原的表位进行串联所得到多表位多肽疫苗可以激发更有效的免疫应 答。目前的已知的SEB的B细胞表位有5个，所用的筛选方法主要是生物信息学预测和单 克隆抗体筛选。用生物信息学预测抗原的B细胞表位准确率不高，预测出的表位仅局限于 特定长度的肽段，无法预测免疫优势表位。研宄也证实，实验所得的B细胞表位与生物信息 学软件预测的结果并不一致。用单克隆抗体筛选抗原的B细胞表位步骤繁琐，试验周期长， 所鉴定的抗原B细胞表位的不全，也无法鉴定免疫优势表位。因此，建立一种准确有效的筛 选及鉴定B细胞免疫优势表位的方法显得尤为重要。
【发明内容】
[0008] 本发明提供一种金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽，其氨基酸序 列如SEQ ID NO:42所示。其对应的核心表位的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:69所示。
[0009] 本发明提供一种鉴定所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽的 方法，其主要包含步骤：
[0010] 1)用金黄色葡萄球菌肠毒素B的突变体免疫小鼠获得抗血清；
[0011] 2)步移合成覆盖金黄色葡萄球菌肠毒素B全长序列的重叠18肽；
[0012] 3)用步骤1)所得的抗血清结合步骤2)所得的重叠18肽筛选金黄色葡萄球菌肠 毒素B的B细胞免疫优势表位肽；
[0013] 4)用步骤3)所筛得的B细胞免疫优势表位肽与钥孔血蓝蛋白偶联，所得偶联物用 于动物免疫，获得免疫优势肽抗血清；所述免疫优势表位抗血清进行金黄色葡萄球菌肠毒 素B的中和能力检测，鉴定所述B细胞免疫优势表位肽为目标B细胞免疫优势表位肽。
[0014] 进一步地，上述鉴定方法包含步骤：
[0015] 5)针对步骤3)所得的B细胞免疫优势表位肽序列，从N-端及C-端分别依次截断 2个氨基酸，合成各B细胞免疫优势表位肽所对应的截断肽；
[0016] 6)用步骤4)获得的所述免疫优势肽抗血清结合步骤5)所述的截断肽，来确定所 述B细胞免疫优势表位肽的最小表位；
[0017] 7)用步骤6)所筛得的B细胞免疫优势表位肽的最小表位与钥孔血蓝蛋白蛋白偶 联，所得偶联物用于动物免疫，获得免疫优势表位抗血清；
[0018] 8)用步骤7)获得的所述免疫优势表位抗血清进行金黄色葡萄球菌肠毒素B的中 和能力检测；
[0019] 9)用生物信息学方法确定步骤6)所确定的B细胞免疫优势表位肽的最小表位在 金黄色葡萄球菌各个菌株中的保守性，并明确其在金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白三维结构 中的位置。
[0020] 所述的金黄色葡萄球菌肠毒素B的B细胞免疫优势表位肽具有高免疫原性，可引 发强烈的免疫反应；用所述免疫优势表位免疫动物所获的抗血清均具有特异性中和SEB毒 素的作用。所述免疫优势表位不含有不必要甚至有害的部分，从而降低由其所制备的疫苗 的使用风险，具有较大的疫苗应用价值，可用于制备金黄色葡萄球菌肠毒素B表位疫苗和/ 或预防疫苗。
[0021] 本发明通过用SEB突变体（rSEB)免疫BALB/c小鼠获得预防S. aureus (金黄色葡 萄球菌）感染的抗血清，结合覆盖SEB全长的42条重叠肽逐步筛选出了 SEB的B细胞三个 免疫优势表位肽。用免疫优势表位肽一KLH(钥孔血蓝蛋白）偶联物免疫动物，获得的了可 强烈结合SEB毒素的表位肽特异性抗血清。接着用分别覆盖三个免疫优势表位肽的多个截 断重叠肽与该表位肽抗血清进行进一步筛选，明确了该免疫优势表位肽的核心序列即优势 表位。在体外，鉴定的三个免疫优势表位均可中和天然SEB毒素的超抗原能力。本发明所 提供的筛选和鉴定方法准确率高，可以避免漏筛和误筛现象，可以区别抗原表位的免疫显 性和免疫亚显性，并且所筛选出的抗原表位均能在动物体内诱发高水平优势表位抗血清， 并且该抗血清具有中和SEB毒素超抗原能力的功能，由此使得制备高效、低毒、高安全性的 基于SEB的疫苗成为可能。
[0022] 本发明用覆盖抗原蛋白全长的多组重叠肽结合ELISA法筛选金黄色葡萄球菌肠 毒素B的免疫优势B细胞表位肽，进一步用覆盖优势表位肽全长的截断重叠肽结合ELISA 法来明确该优势表位肽的核心序列，方法简便快速，表位无遗漏，获得了金黄色葡萄球菌肠 毒素B的B细胞的三个免疫优势表位。该免疫优势表位均具有较强的免疫原性，用该优势 表位免疫动物，免疫制剂无无关成分或有害成分，可获得高水平的优势表位抗血清，并且， 该抗血清可强烈中和SEB毒素的超抗原能力。以该优势表位为活性成分的疫苗比SEB全 蛋白突变体疫苗具有更好的预防和中和诱发的SEB毒素的作用，由于优势表位SEB 97_112及 SEB2(I7_222在多种S. aureus菌株中序列保守，提示其对其他S. aureus感染也具有良好的应 用前景。
[0023] 为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例， 并配合附图，作详细说明如下。
【附图说明】
[0024] 图1为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位肽的筛选。
[0025] 图2为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位肽抗血清与天然SEB的结合检 测。
[0026] 图3Ai至图3Cii为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势表位的最小表位确定；其 中
[0027] 图3Ai为SEB97_112的最小表位确定；
[0028] 图3Bi为SEB2Q7_222的最小表位确定；
[0029] 图3Ci为SEB247_257的最小表位确定；
[0030] 图3Aii，图3Bii及图3Cii分别是亚优势表位肽 SEB31-48, SEB133-15。及 SEB 193_210的 核心序列。
[0031]图4A至图4D为金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫优势最小表位抗血清对该毒素的 中和能力的检测；其中
[0032]图4A为免疫优势最小表位抗血清中和了金黄色葡萄球菌肠毒素B诱导的T细胞 增殖；
[0033] 图4B为免疫优