专利名称：一种定量检测葡萄球菌肠毒素b的蛋白质悬浮芯片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种定量检测葡萄球菌肠毒素B的蛋白质悬浮芯片及其制备方法。
背景技术：
金黄色葡萄球菌肠毒素B (staphylococcal enterotoxin B, SEB )是引起食物中毒的主要致病因素。食物中毒发病较急，通常在进食含毒素食品l-6小时内发作，平均2-3小时。
SEB常规实验室诊断方法有1 )免疫扩散0udin单向扩散技术可用于葡萄球菌肠毒素的准确定量测定，易重复，不受温度、抗血清稀释度及作用时间等影响。检测各型葡萄球菌肠毒素的敏感度在10-20pg/mL左右。2)放射免疫法(RIA):检测食品中的肠毒素A及B，较免疫扩散法敏感100倍。3)反向被动血凝试验(RPHA):可将毒素分型，且有较高的特异性和敏感性。用改良的RPHA法测定葡萄球菌肠毒素时，食物中纯化葡萄球菌肠毒素的最低检出浓度为l-5ng/mL。本法优点为简便、快速，且对食品中低浓度毒素不需浓缩即可检出。4)被动血凝抑制试验(RPIA ):用戊二醛为结合剂，以冻干致每文红细胞作净皮动血凝抑制试验测定葡萄球菌肠毒素B。可测出0. Olng葡萄球菌肠毒素，但如食品浸出液不纯，常可干扰检查结果。SEB的检测研究在平时和战时都有重要意义。本发明选择SEB作为葡萄球菌肠毒素的代表建立检测模型。
悬浮芯片(suspension array)也称液相芯片(1 iquid array, liquidchip),是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术，利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定。最早的报道是19"年Horan将该技术用于免疫学检测，至今，该技术已广泛应用于免疫分析、核S吏研究、酶学分析、抗体筛选及受体与配体的识别分析等领域。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生ioo种不同比例颜色，作为IOO种独特的色彩编号，每颗微球大小约5. 5jim，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。标记探针的微球与待测物在96孔板中进行反应。反应后，利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管检测通道，每次仅允许一个微球通过检测通道。检测通道中设有两道激光，一道为红色，激发微球基质中的颜色，识别微球分类编码以确定检测项目；一道为绿色，激发报告分子的颜色，记录信号强弱以检测待测物的含量。当待测样本与特定微球的探针吸附在一起时，两道激光所激发的光都可
被检测到。而若样本中不含该标的物，则仅有微球中的激发光可被检测到。再通过机器与计算机自动统计分析两道激光所激发的微球种类与数量，从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中，得知测试样本中有无待测病原存在，或同时存在有几种至数十种病原。
本研究选择金黄色葡萄球菌肠毒素B作为病原体和生物威胁因子，制备相应的蛋白质悬浮芯片并且用于对实际生活领域中如奶粉、面粉、淀粉、果珍等粉末样品中的快速检测，分析悬浮芯片方法在白色粉末模拟样品检测中的应用情况，包括敏感性、特异性、稳定性以及针对不同样品、具有杂菌干扰下检测方法的适用性。
发明内容
本发明涉及一种定量检测葡萄球菌肠毒素，特别是金黄色葡萄球菌肠毒素B的蛋白悬浮芯片及其制备方法，还涉及本发明的蛋白质悬浮芯片在定量、快速、直接检测葡萄球菌肠毒素、尤其是金黄色葡萄球菌肠毒素B中的应用和4企测方法。
本发明人通过大量和深入的研究，开创性开发出本发明的葡萄球菌肠毒素检测蛋白质悬浮芯片及其检测方法具有以下优点制备的蛋白质悬浮芯片能够更快速、定量检测所述病原体，特异性强；蛋白质悬浮芯片检测方法比ELISA方法检测敏感度高，并且动态范围更宽；为所述病原体的定量检测建立技术模型，例如蓖麻毒素，而且还可以进一步奖所述蛋白悬浮芯片应用于其他植物毒素等。
本发明提供一种定量检测葡萄球菌肠毒素的蛋白质悬浮芯片，该悬
5浮芯片由编码微球包被抗体、生物素化抗体、链亲和素-藻红蛋白(SA-PE )及緩冲溶液构成，该微球用抗葡萄球菌肠毒素B ( SEB )的特异性抗体包被，生物素标记的抗体为SEB特异性抗体。
本发明还提供一种制备所述蛋白质悬浮芯片的方法，该方法包括下列步骤(1)用捕获抗体包被编码微球，(2)生物素标记检测抗体，(3)样品4金测方法。
本发明还提供一种定量检测葡萄^求菌肠毒素的方法，该方法包括下列步骤(1 )用抗葡萄球菌肠毒素抗体包被编码微球，(2)生物素标记检测抗葡萄球菌肠毒素抗体，(3)样品检测方法。
在芯片和方法的开发过程中，本发明对所述蛋白质悬浮芯片及其制备方法和检测方法条件进行了大量和复杂的摸索和研究，并且取得了以下多个方面的改进
1、 抗体包被量的改进
抗体的包被量需要以检测效果进行优化，本研究中各抗体的包被量自9-12pg始，以2倍、4倍的梯度测试，选择在10-12pg即可。
2、 生物素标记的改进
标记抗体所用的生物素是过量的，过量的值试剂盒中有参考的计算公式。理论上讲，在检测过程中，过量的生物素因未标记上抗体而不一皮微球上结合捕获抗体的抗原连接，清洗时被抽滤掉，不会与随后加入的SA-PE反应，不影响检测。但在实际检测过程中，偶尔遇到过检测信号可能降低的现象，因此建议生物素标记抗体后，尽量去除多余的生物素。3 、 检测的灵敏度及动态范围
本发明的悬浮芯片方法与经典的免疫学^f全测方法-一ELISA相比，结果有着很好的吻合性，但悬浮芯片方法比ELISA灵敏度高，动态检测范围更宽。悬浮芯片方法灵壽丈度高于免疫学方法的经典标准-ELISA方法，也从对多份样品的检测结果得到印证。
在本发明制备蛋白质悬浮芯片中，抗原可以选自天然提纯、经蛋白层析系统(Sapherose 4B,蛋白质G柱)纯化的SEB。捕获抗体为SEB单抗，也可为兔抗SEB。检测抗体为Bio-兔抗SEB,也可为Bio-SEB单抗。通过检测SEB的对比试验，本发明的悬浮芯片和ELISA方法有很好的一致性(W为0. 9785 )，但是ELISA检测SEB的最低检测浓度为60ng/mL,
6线性范围为100-800ng/mL。本发明的悬浮芯片在才企测中比ELISA法灵敏度高300倍，动态范围更宽。
经与对应ELISE方法对比研究，和人工污染样品;险测、实4全室标准测试、盲样测试等初步评价和考核，本研究建立的悬浮芯片多病原体定量检测方法比ELISA方法具有更高的敏感性和更宽的动态4企测范围，实现病原体的定量检测，对目标分析物的检测不受其它病原体存在等背景干扰的影响，可用于"白色粉末"等环境和食品样品的检测，检测的灵敏度和动态范围受不同样品基质的影响而有所改变。悬浮芯片检测方法的建立对于蓖麻毒素的快速检测，对可疑环境样品中生物恐怖因子的检测具有非常重要的意义。
我们发展了编码微球悬浮芯片可实现蓖麻毒素的同时定量检测。考察了方法的灵敏度、特异性、多重检测能力、检测粉末样品的适用性等，并与ELISA方法进行对比，悬浮芯片方法的灵壽t度分别高于对应的ELISA方法。对人工污染样品和盲样的测试结果也证明了编码孩O求悬浮芯片定量检测方法的实用性。
本研究建立的悬浮芯片多病原体定量检测模型，为进一步解决检测技术达到准确、快速、简便、多功能、多指标、高通量、标准化的要求奠定了基础。
图1:用43号微球包被SEB抗体检测示意图；图2:编码微球悬浮芯片检测SEB的标准曲线图；图3: ELISA方法;^测SEB标准曲线图；图4:微J求芯片与ELISA方法4全测SEB的吻合性；图5:奶^分样品中SEB剂量-反应动态曲线。
具体实施例方式
本发明涉及的定量检测葡萄球菌肠毒素的蛋白质悬浮芯片及其制备方法将以下列具体实施方式
对本发明作进一步说明，但本发明不以任何方式受该实施例的限制。一、材料
7本发明采用下列緩冲液来制备悬浮芯片并进行目标物的检测
(1) 0. 03M PB緩沖液(pH7. 2 ): 2. 83g Na2HP04， 1. 36g ,04定容至1L。
(2) PB: 0. OIM磷酸盐緩沖液，pH7. 2。用0. 03M PB緩沖液稀释而成。
(3) PBS(pH7. 4 ): NaCl 137mmol/L; KC1 2. 7mmol/L; Na2HP0410mmol/L;KH2P04 2誦ol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl， 0. 2gKCl， 1. 44g Na2HP04和0. 24g KH2P04。用HC1调节溶液的pH值至7. 4,加水至1L。分装后在15psi (1.05kg/cm2)高压蒸汽2Qmin，或过滤除菌，保存于室温。
(4) 微球清洗液PBS (pH7. 4), 0.05% TWEEN-20。
(5 )微球活化緩沖液100 mM NaH2P04: 3g NaH2P04， 5N NaOH 1. 5 mL,定容于250mL， pH 6. 2。
(6 )微球包被缓沖液0. 05 MMES， pH 5. 0: 2.44gMES， 5NNaOH0.15mL,定容于250mL。
(7 M鼓J泉寸呆存液PBS-TBN: PBS， 0. 1%BSA， 0. 02% TWEEN, 0. 05°/。Azide，pH7.4。
(8) 微球封闭液PBS-BN: PBS, 1°歸,0. 05%Azide, pH7. 4。
(9) 检测緩沖液PBS， 1%BSA， pH7. 4。
(10 )抗体稀释液0. 01 mmol/L PB ( pH7. 2 )。
(11) 微球稀释液PBS， 1°/。BSA， pH7.4。
(12) 样品稀释液:0. OIMPB， pH7. 2。
(13 )生物素化抗体稀释液:PBS-TBN(PBS， 0.鹿A, 0. 02% TWEEN-20,
0. 05%NaN3， pH7. 4)。
(14) SA-PE稀释液:PBS(pH7.4)，簡A。二、待测样品的制备
1、 样品的制备
目标检测物样品为葡萄球菌肠毒素B ( SEB )。干扰样品或作为方法特异性测试的样品是目标检测物外的其它细菌或其它蛋白质，包括BONT、重组HIV P24抗原、BSA、酪蛋白、胰蛋白胨、禽流感病毒HA蛋白、NH蛋白等。将上述待分析样品均溶在样品稀释液PB ( 0. 01M, pHL 2 )溶液中，4。C保存。SEB的储备液浓度均为lmg/mL。毒素和重组蛋白质样品在临用前稀释。SEB的浓度范围为10pg/mL-5jug/mL。比较实验中，同样的样品 用于ELISA和悬浮芯片的检测。
待分析的细菌用PB稀释成IO倍不同梯度，葡萄球菌肠毒素用PB稀 释成4倍不同梯度，以绘制样品检测剂量-反应的标准曲线，其中几个样 品浓度低于检测的敏感度，高浓度样品应使编码微球的结合位点处于饱 和状态。
2、模拟添加样品的制备
分别将0. 5g奶粉、玉米淀粉、小麦面粉、速溶果珍等粉末加入到5mL 样品稀释液(PB緩沖液)中，将不同浓度的炭疽芽孢、鼠疫菌、SARS-CoV N蛋白、蓖麻毒素和SEB的其中 一种或几种，掺入到粉末样品中，经V0TEX 充分混匀，静置2h以上，使目标分析物与模拟白色粉末充分吸附。再 用脱脂棉、薄滤纸、厚滤纸、0. 45，滤膜滤纸过滤或低速离心(1000rpm, 2min )后，上清液作为待检样品进行悬浮芯片方法的检测。 三、抗原抗体
天然提纯、经蛋白层析系统(Sapherose 4B, Protein G柱)纯化的 SEB、 Bio-兔抗SEB经正辛酸-饱和碌u酸铵提纯法纯化抗体IgG。
实施例l、捕获抗体包4皮编码孩i球
兔抗SEB经正辛酸-饱和碌u酸4妄l是纯法纯化。任选一种编码的孩t球(如 043 )标记捕获SEB的抗体(SEB抗体)。
A、 编码微球的活化
取100|aL编码微球到1.5mL离心管中，14000g离心，小心吸出并弃 去上清液。加入lOO(iL的微球清洗緩沖液悬浮，震荡并超声后14000 g 离心，小心吸出并弃去上清液。加入lOOiaL的微球活化緩冲液，接着先 加入10 |i L新鲜配置的EDC ( 50mg/mL )，紧接着加入10 |i L新鲜配置的 Sulfo-NHS ( 50mg/mL ),在室温震摇20min。加入150 (a L的PBS ( pH7. 4 ), 震荡后，14000 g离心，小心吸出并弃去上清液。加入100 (a L的PBS( pH7. 4 ) 悬浮编码微球。
B、 用抗体包被编码微球
取相应的抗体5-50 |a g加入到活化后的编码樣i球中，用PBS ( pH7. 4 ) 定容至500juL，室温震摇2小时。14000 g离心，小心吸出并弃去上清液。用500 pL的PBS (pH7. 4)洗一次，14000 g离心，小心吸出并弃去 上清液。加入250|uL的封闭緩冲液悬浮编码微球，在室温震摇30min, 14000g离心，小心吸出并弃去上清液。加入500juL的微球保存液洗涤编 码微球，16000g离心，小心吸出并弃去上清液。最后用150fiL的微球保 存液悬浮编码微球，于4'C避光保存备用。 C、包被微球的计数
吸取适量微球，稀释后，用血球计数板(O. 10mm; 1/400mm2)在普通显 微镜下计数。根据公式(每个大格数x 104 x稀释倍数x体积(mL ))计算 微球数量。
实施例2、检测抗体的生物素标记
待标记的抗体包括兔抗SEB抗体、羊抗SEB抗体、SEB单抗，针对每 种分析物标记生物素的检测抗体至少有两种备选。分别配制好浓度为 10mM生物素溶液和2mg/mL的待标记抗体溶液，将计算好体积的生物素加 入到待标记抗体溶液中，在室温震摇30min (或水上2小时)，过柱脱盐 后分装，-20。C冻存备用。
实施例3、悬浮芯片的检测
采用双抗体夹心免疫学检测模式，检测过程中全部反应均在96孔滤 板上进行。
1) 每孔加入50juL含相应编码微球的工作溶液，洗液洗涤并用真空 泵抽滤；
2) 加入50 laL冲企测样品，混匀后室温避光震摇30min,洗液洗涤并 抽滤；
3) 加入50 juL适当浓度的用抗体稀释液稀释后的生物素化抗体，混 匀后室温避光震摇3Omin,洗液洗涤并真空泵抽滤；
4) 加入50 )LiL的SA-PE，混匀后室温避光震摇10min。洗液洗涤并真 空泵抽滤；
5) 加入125jaL的;f佥测緩冲液，经VOTEX重悬混匀；
6) 用悬浮芯片系统读取FMI数值并分析数据。 上述一企测过程可在30分钟完成96个样品中目标物的4企测。实施例4、葡萄球菌肠毒素B的悬浮芯片检测法
优化的悬浮芯片检测系统可成功用于SEB检测。包被SEB抗体的043 号微球均落在其正确检测区域内，见图1所示。方法优化后选择的抗体 对组合为微球包被SEB的单抗(抗体包被量为10pg /1. 25 x l(f个编码 微球)，检测抗体为1: 50的Bio-兔抗SEB (标记浓度为lmg/mL)。
实施例5、悬浮芯片方法检测SEB的标准曲线
编码微球悬浮芯片检测SEB的标准曲线包含6个数量级的点(图2)。 检测seb从7. 5 m g/mL开始4倍系列稀释至10pg/mL。检测动态范围为
0、 02-1653. 4ng/mL， LOD为203pg/mL。
实施例6、本发明悬浮芯片与ELISA法检测SEB的比较
将SEB用样品稀释緩冲液稀释成不同浓度梯度，用悬浮芯片及ELISA 方法平行检测，比较悬浮芯片与ELISA方法的符合情况和方法的敏感性。 取三次ELISA检测的平均值作为检测值绘制标准曲线，见图3。零含量检 测样品的检测值为空白值。ELISA方法的LOD值耳又OD值与空白值之比为 2. 1时的检测浓度。悬浮芯片与ELISA方法检测结果吻合性比较见图4, 图中实线代表两种方法分别对相同样品检测值的连接线，虚线为添加的 趋势线。两种检测方法L0D值的比较结果见表1。
1、 ELISA方法
在建立的ELISA方法中，每种检测物所用捕获抗体和;险测抗体的配对 组合尽可能与对应的悬浮芯片方法所用抗体对一致。不同检测物的捕获 抗体分别用PB緩冲液稀释后，ELISA板每孔包被量200ng-l jug。检测样 品分别对应于悬浮芯片单因子分析物检测样品。
其余检测过程同第 一部分相应内容。
2、 悬浮芯片的定量检测
SEB储备液中稀释检测样品，检测后在对应的标准曲线上读取其含 量；样品三次检测，取检测信号平均值并计算其标准差、变异系数，考 核检测的重复性。
3、 悬浮芯片与ELISA方法检测SEB敏感度和检测范围比较表1:悬浮芯片方法与ELISA方法检测性能比较
X-MAPELISA相关
检测对象灵敏度动态范围灵敏度线性范围系数
SEB203pg/mL0. 02-1653. 4ng60ng/mL100-8000. 92
/mLng/mL69
通过检SEB，比较悬浮芯片和ELISA方法的检测性能，可以得出结论， 检测同类样品，在一定浓度范围内，悬浮芯片方法与ELISA方法有很好 的相关性。悬浮芯片比ELISA方法具有更高的检测灵敏度和更宽的动态 范围，但是对不同的检测物，性能优越程度不同，具体见表l。本发明的 悬浮芯片和ELISA方法有很好的一致性(W为0. 9785 )。 ELISA冲全测SEB 的最低检测浓度为60ng/mL,线性范围为100-800ng/mL。悬浮芯片方法 比ELISA法灵每丈度高300倍，动态范围更宽。
实施例7、悬浮芯片方法的特异性
1、 悬浮芯片方法对不同菌和蛋白质的检测
通过悬浮芯片方法特异性测试，结果显示，蓖麻毒素、SARS-CoV N 蛋白、大肠埃希氏菌、变形杆菌、禽流感病毒HA蛋白、禽流感病毒NH 蛋白、酪蛋白、BSA、 B0NT、胰蛋白胨等MFI值与空白对照的MFI值没有 显著性的差异，说明以上细菌、病毒、毒素及其它蛋白质均不与目标检 测物发生交叉反应或非特异性反应。
2、 悬浮芯片定量检测SEB
依次准备不同浓度的SEB样品，用悬浮芯片方法检测后，套用剂量-反应标准曲线，得出样品中SEB的定量检测浓度。每个样品检测3次，取 其焚光检测信号的平均值(MFI)，进行对应检测浓度及标准差的计算， 结果见表2。样品中SEB从0. 46 ng/mL到468. 75ng/mL五个浓度水平， 均可定量检出，平均变异系数6. 788%。
_表2:悬浮芯片定量检测SEB结果
编理论值检测值MFI 标准差变异系 号ng/mL ng/mL 数
121 0.46 0.50 22.3 1.06 5.98
2 1.83 1.77 81. 8 13. 08 16.93
3 29.30 28.54 1278.3 80.26 6.30
4 117.19 131.21 2486.8 85.21 3.43
5 468.75 329.08 2638.8 0.98 1.30
实施例8、本发明悬浮芯片检测样本中的SEB 奶粉人工污染样品中SEB定量检测
将SEB定量添加到奶粉样品中，以4. 25 x 1(Tcfu/mL始4倍梯度进行系 列稀释，绘制剂量-反应曲线(图5)。奶粉样品中SEB的动态检测范围约为 1-62500 ng/mL。对奶4分中添加SEB样品进行定量冲全测，以;险测值与添加 值之比计算检测效率，见表3。
表3:模拟奶粉样品添加SEB的纟企测效率
理论值检测值检测效
ng/mLng/mL率 * 100
16. 3415. 26107
48. 9561. 0480
901. 79244. 14369
1499. 55976. 56154
结论
经与对应ELISE方法对比研究，和人工污染样品检测、实-险室标准 测试、盲样测试等初步评价和考核，本研究建立的悬浮芯片多病原体定 量检测方法比ELISA方法具有更高的敏感性和更宽的动态检测范围，实 现病原体的定量检测，对目标分析物的检测不受其它病原体存在等背景 千扰的影响，可用于"白色粉末"等环境和食品样品的检测，检测的灵 敏度和动态范围受不同样品基质的影响而有所改变。在奶粉中悬浮芯片 方法检测SEB的灵敏度分别为2. 2 ng/mL，并分别在1-62500 ng/mL浓度 范围内有很好的剂量-反应关系。
悬浮芯片检测方法的建立对于SEB的快速检测，对可疑环境样品中生物恐怖因子的^r测具有非常重要的意义。
本研究建立的悬浮芯片多病原体定量检测模型，为进一步解决检测 技术达到准确、快速、简便、多功能、多指标、高通量、标准化的要求
奠定了J^5出
权利要求
1、一种定量检测葡萄球菌肠毒素B的蛋白悬浮芯片，其特征在于，所述悬浮芯片由带荧光素内标的聚苯乙烯编码微球构成，该微球用可以捕获相应目标分子的抗体包被，生物素标记所述的抗体，亲和素化的荧光藻红蛋白。
2、 如权利要求l所述的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，所述的包被微J泉的抗体可为单抗，也可为多抗。
3、 如权利要求1所述的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，悬浮芯片所需的抗体包被量为每孔20-40ng/2500-5000个微球/测试。
4、 如权利要求2所述的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，所述生物素化的检测抗体选自生物素化的兔抗SEB单抗或多抗中的一种或多种。
5、 如权利要求2所述的蛋白质悬浮芯片，其特征在于，选定微球标记的SEB抗体为捕获抗体，选自生物素标记的SEB抗体作为^r测抗体，用于双抗体夹心模式的悬浮芯片检测葡萄球菌肠毒素。
6、 一种所述的蛋白质悬浮芯片的制备方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(l)活化编码微球，(2)用捕获抗体包被编码微球并计数，(3)用生物素标记检测抗体，(4)清洗液洗涤。
7、 如权利要求6所述的制备方法，其中所述的包被纟敬球的抗体选自兔抗SEB、 SEB单抗、羊抗SEB中的一种或多种。
8、 如权利要求6所述的制备方法，其中所述生物素化的检测抗体及其用量可以选自6pg-40]ig兔抗SEB、 SEB单抗、羊抗SEB中的一种或多种。
9、 如权利要求6所述的制备方法，其中所述方法中的生物素为羧基活性2的生物素。
10、 一种定量检测葡萄球菌肠毒素的方法，其特征在于，该方法包括下列步骤(1)用抗葡萄球菌肠毒素抗体包被编码微球，(2)生物素标记检测抗葡萄球菌肠毒素抗体，(3)样品检测的，其中所述所述的包被微球的抗体选自兔抗SEB、 SEB单抗、羊抗SEB中的一种或多种。
全文摘要
本发明的目的在于可定量检测细菌毒素的蛋白质悬浮芯片及其制备方法，尤其是适合定量检测和分析葡萄球菌肠毒素的蛋白质悬浮芯片。本发明的方法灵敏度高、特异性强、建立了新的检测模式化平台、检测能力好、动态范围宽。
文档编号G01N33/569GK101498720SQ200910078818
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月4日 优先权日2009年3月4日
发明者姜永强, 孙肖红, 宇 杨, 静 王, 胡孔新, 谢士嘉 申请人:中国检验检疫科学研究院