专利名称：一种葡萄球菌肠毒素探测方法
技术领域：
本发明属于生化探测领域，涉及一种新型的葡萄球菌肠毒素探测方法，特别涉及一种利 用LSPR技术的快速高灵敏度葡萄球菌肠毒素探测方法。
背景技术：
快速检测并确定生物病菌的种类是各国发展检测手段的主要目的，面对多种类型的生化 战剂，基于各种原理的探测方法相继问世，即便是对于同一病菌来说，也出现了多种检测方 法。以B型葡萄球菌肠毒素(SEB)为例，它是金黄色葡萄球菌肠毒素系列(SEA SEE)之一， 具有极强的耐热性和抗药性，检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、聚合酶链反应法(PCR) 等。ELISA法是检测SEB最常用的方法，优点是操作简便、检测方法标准化，所需试剂易得， 目前商用的ELISA试剂盒检测水平普遍为1 20ng/mL，但其主要缺点是检测时间较长(约4 小时)，需用试剂较多。PCR反应检测优点是对于活体和死体均能检测，能检测多个样品，缺 点是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，导致结果的误判，此外还需使用扩增 仪等专业仪器，普及化的检验工作带来困难。目前PCR分析技术检测限为检测水平小于lng/mL 左右，检测时间根据实验方法和对象在2 5小时不等，同样不能满足短时间内检测的需求。 迫切需要发展一种快速高灵敏度的检测方法，该方法不仅可以应用于金葡萄球菌感染检测和 食品检测中，而且在对病菌的抗药性、耐热性分析中都有重要应用。
发明内容
本发明要解决的问题是克服现有葡萄球菌肠毒素探测需要特殊设备、探测时间长等缺
点，利用LSRP (局域表面等离子体技术)及生化分子间的特异性反应，通过观察光谱移动实
现葡萄球菌肠毒素快速、高灵敏度、免标记探测。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在 于包含以下步骤
(1) 制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；
(2) 对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；
(3) 测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；
(4) 然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原一抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。 所述的探测芯片上可附带的探测对象为金黄色葡萄球菌肠毒素系列SEA SEE中的一种、
或多种；所述的葡萄球菌肠毒素浓度探测下限可优于lng/ml。 所述探测芯片的通过以下歩骤制各-
(a) 选用探测芯片基底、清洗并作亲水处理；
(b) 在基底表面通过纳米球自组装、或光刻、或纳米压印制作M1纳米结构；
(c) 将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金属结构的探测芯片。 上述所述歩骤(a)中的芯片基底的材料为玻璃、或石英、或硅、或锗。 所述探测构芯的结构可以根据探测对象的特点设计、制作成三角形、或菱形、或五角虽
形、或圆柱形、或双层复合结构；其中将纳米结构金属化所采用的金属材料为金、或银、或 银表面复合金。
所述的探测芯片为阵列化芯片，其结构特征尺寸为30nm 1000nm;列阵数从"1 10x10，通过点样等方式针对不同种类的葡萄球菌肠毒素活化不同子单元，实现高效、多通道 并行检测。
所述步骤(2)中的活化步骤如下首先采用亚二硫基二乙酸活化金属结构表面；然后采 用乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液活化羧基基团，使金属表 面带上活性的羧基基团；最后通入抗葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG，并且利用乙醇胺水 溶液封闭多余的活性酯基团，完成整个芯片的活化过程。
所述步骤(4)中的检测环境为大气环境下，同时温度在一50。C 80。C。
所述步骤(4)中的待测物反应时间为1分钟到1小时。
所述的分析光谱移动状况是指光谱谱峰位置移动量大于10nm。
本发明与现有技术相比所具有的优点是本方法具有不需要复杂设备、不需要使用放射 性同位素、酶或荧光等做为标识物，芯片制备完成后，可长吋间放置，所需的探测时间短。 具有快速、高灵敏度、应用范围广、安全、稳定性高等显著特点，为快速检测葡萄球菌肠毒 素提供一种简单实用的新方法。
图1是本发明快速高灵敏度葡萄球菌肠毒素测试的流程示意图； 图2是本发明实施例1中芯片活化前测试所得的基准值； 图3是本发明实施例1中浓度为10吗/ml的SEB的检测结果示意图； 图4是本发明实施例2中浓度为0.1 u g/ml的SEB的检测结果示意图；图5是是本发明实施例3中浓度为lng/ml的SEB的检测结果示意图；
具体实施例方式
下面结合附图及具体实施方式
详细介绍本发明。
'本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法，其具体探测流程图如图1所示；包含以下歩骤 (1 )制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；
(2) 对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；
(3) 测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；
(4) 然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原一 抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。
实施例1
本实施例是采用石英材料基底上，特征尺寸为1000nm的金属银结构的探测芯片，采用 本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为i0p g/ml的SEB的探测。
首先采用石英材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过光刻制作出面积 约10mmX10mm，特征尺寸为1000nm，列阵数为10x10的圆柱形结构；通过镀金，将纳米 结构金属化，获得在基底表面有纳米金结构的芯片。然后将2mM的亚二巯基二乙酸水溶液滴 加在样片表面，反应2(kiin;将0.4M的乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与0. 1M的羟基硫代琥铂酰 亚胺NHS混合溶液滴加在探测芯片表面，活化羧基基团20min;然后用0. 01M磷酸盐PBS缓 冲液进行彻底冲洗，用高压氮气吹干；滴加10 ug/ml的抗SEB的羊单克隆抗体IgG在基底 表面，IgG通过碱性氨基酸(Arg和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应，从而被固定在 膜上；然后1M乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗备用。在室温大气 环境内，测试出该芯片的基准光谱峰值为608咖，滴加浓度为10tig/rnl的SEB溶液200 p 1 在芯片表面，反应20rain后，用高压氮气吹干。放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原一 抗体分子间的特异性反应，在室温大气环境内，观察光谱移动状况，测试出反应后的芯片光 谱峰值为582nm，如图3所示。光谱峰值移动大于10nm。
实施例2
本实施例是采用锗材料基底上，特征尺寸为500nm金银复合结构的探测芯片，采用本发 明的葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为0. 1 u g/ml的SEB的探测。
首先釆用锗材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过纳米压印制作出面 积约500timX500jini，特征尺寸为500nm，列阵数为4x4的五角星形结构；通过镀银将纳米 结构金属化，获得在基底表面有纳米银结构的芯片；然后，再结构上蒸镀一层10nm厚的金，
6形成双层复合结构。然后将2mM的亚二巯基二乙酸水溶液滴加在样片表面，反应20min;将 0.4M的乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与0. 1M的羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液滴加在探测 芯片表面，活化羧基基团20min;然后用O.OIM磷酸盐PBS缓冲液进行彻底冲洗，用高压氮 气吹干；滴加10 U g/ml的抗SEB的羊单克隆抗体IgG在基底表面，Tg(;通过碱性氨基酸(Arg 和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应，从而被固定在膜上；然后m乙醇胺水溶液封 闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗，形成特异性生物分子膜。在一10。C的大气环境下， 测试芯片的基准光谱峰值为611nm，滴加浓度为0. lug/ml的SEB溶液反应后，芯片光谱峰 值为528nm,如图4所示。 实施例3
本实施例是采用硅材料基底上，特征尺寸为30nm的金结构的探测芯片，采用本发明的 葡萄球菌肠毒素探测方法实现对浓度为lng/ml的SEB的探测。
首先采用硅材料作为芯片基底、清洗并作亲水处理；在基底表面通过纳米球自组装制作 出面积约20MmX2(^im，特征尺寸为30nm，列阵数为lxl的四边形排布的菱形纳米结构；通 过镀银将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金厲结构的芯片。然后将2mM的亚一巯基 二乙酸水溶液滴加在样片表面，反应20min;将0.4M的乙基碳二亚胺盐酸.盐EDC与0. 1M的 羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液滴加在探测芯片表面，活化羧基基团20min;然后用0. O]M 磷酸盐PBS缓冲液进行彻底冲洗，用高压氮气吹干；滴加10 y g/ml的抗SEB的羊单克隆抗 体IgG在基底表面，IgG通过碱性氨基酸(Arg和Lys)侧链上的氨基基团与活化的羧基反应， 从而被固定在膜上；然后1M乙醇胺水溶液封闭多余的活性酯基团；最后用缓冲液清洗，形 成特异性生物分子膜。经测试，芯片的基准光谱峰值为539nm。滴加浓度为lng/ml的SEB溶 液反应后，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原一抗体分子间的特异 性反应，观察光谱移动状况，芯片光谱峰值为573nm，如图5所示。光谱峰值移动大于10nra。
实施例4
本实施例是采用玻璃基底上的阵列芯片，采用本发明的葡萄球菌肠毒素探测方法对不同 类型的葡萄球菌肠毒素进行探测。
首先采用玻璃作为芯片基底、清洗并作亲水处理；通过光刻分区的方法在玻璃基底上制 作出7X7多孔阵列芯片，根据探测对象的不同，每个子单元内的纳米结构可以各不相同，然 后通过镀膜将结构金属化。采用5mM的亚二硫基二乙酸对金属金表面进行活化，然后将乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC) (0.8M)与羟基硫代琥铂酰亚胺(NHS) (0.3M)混合溶液活化羧 基基团，使金属表面带上活性的羧基基团，羧基基团可以与生物分子的活性成分发生反应，
7以固定生物分子。通入抗葡萄球菌肠毒素抗体，利用乙醇胺水溶液(1M)封闭多余的活性酯 基团，完成整个芯片的活化过程。在大气环境下，测试芯片各列阵单元的基准值。然后通过 点样的方法在不同的列阵单元中引入待测的不同类型的肠毒素。不同类型的肠毒素反应时间 约在1分钟到1小时。待其充分反应后，在大气环境下，放入LSPR传感器中进行测试，利 用抗原一抗体分子间的特异性反应，通过扫描的方式，测试不同子单元的光谱峰值，如果与 前面测试所得的基准值相比较光谱峰值移动量大于lOnm,则可以判断待测样品中的抗原与其 抗体间发生特异性反应，待测样品含有相应的肠毒素成分。
权利要求
1、一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于包含以下步骤(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行检测，利用抗原-抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素。
2、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述的探测芯片上可附带的探测对象为金黄色葡萄球菌肠毒素系列SEA SEE中的一种、或多种；所述的葡萄 球菌肠毒素浓度探测下限可优于lng/ml。
3、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述探测芯片的 通过以下步骤制备(a) 选用探测芯片基底、清洗并作亲水处理；(b) 在基底表面通过纳米球自组装、或光刻、或纳米压印制作出纳米结构；(c) 将纳米结构金属化，获得在基底表面有纳米金属结构的探测芯片。
4、 根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于所述步骤(a)中的芯片基底的材料 为玻璃、或石英、或硅、或锗。
5、 根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于所述探测构芯的结构可以根据探测对 象的特点设计、制作成三角形、或菱形、或五角星形、或圆柱形、或双层复合结构；其中将 纳米结构金属化所采用的金属材料为金、或银、或银表面复合金。
6、 根据权利要求3所述的探测芯片，其特征在于所述的探测芯片为阵列化芯片，其结 构特征尺寸为30nm 1000nm;列阵数从lxl 10x10，通过点样等方式针对不同种类的葡萄 球菌肠毒素活化不同子单元，实现高效、多通道并行检测。
7、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述步骤(2) 中的活化步骤如下首先采用亚二硫基二乙酸活化金属结构表面；然后采用乙基碳二亚胺盐 酸盐EDC与羟基硫代琥铂酰亚胺NHS混合溶液活化羧基基团，使佥属表面带上活性的羧基 基团；最后通入抗葡萄球菌肠毒素羊单克隆抗体IgG，并且利用乙醇胺水溶液封闭多余的活 性酯基团，完成整个芯片的活化过程。
8、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述步骤(4)中的检测环境为大气环境下，同时温度在一50。C 80。C。
9、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述歩骤(4) 中的待测物反应时间为1分钟到1小时。
10、 根据权利要求1所述的一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于所述的分析光 谱移动状况是指光谱谱峰位置移动量大于10nm。
全文摘要
一种葡萄球菌肠毒素探测方法，其特征在于包含以下步骤(1)制备葡萄球菌肠毒素LSPR探测芯片；(2)对芯片金属结构表面进行活化，形成特异性生物分子膜；(3)测试该芯片的消光谱获得结合前的基准值；(4)然后滴上待测样品，待其充分反应后，放入LSPR传感器中进行测试，利用抗原—抗体分子间的特异性反应，观察光谱移动状况，判断待测样品中是否含有葡萄球菌肠毒素，达到无标记、高灵敏度、快速检测。本发明方法不需要复杂设备、不需要使用放射性同位素、酶或荧光等做为标识物，具有快速、高灵敏度、应用范围广、安全、稳定性高等显著特点，为快速检测葡萄球菌肠毒素提供一种简单实用的新方法。
文档编号G01N33/569GK101514988SQ20091007819
公开日2009年8月26日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者史立芳, 朱少丽, 杜春雷, 欢 杨, 罗先刚, 邓启凌 申请人:中国科学院光电技术研究所