耐久肠球菌素突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品领域，具体涉及耐久肠球菌素突变体及其应用。
【背景技术】
[0002] 乳酸菌细菌素是一类乳酸菌代谢过程中由核糖体合成并分泌到环境中具有抑 菌活性的蛋白质或多肽，在食品保藏中极具重要意义。自乳酸链球菌素Nisin商业应用 以来，细菌素的研究开发一直是相关领域的热点。耐久肠球菌素Durancin GL(GenBank: HQ696461. 1)是从西班牙干酪中分离的耐久肠球菌41D株所产生的新型细菌素，尤其 对李斯特菌等食源性人体致病菌具有祀向抑制作用（Du, Lihui，Somkuti, GeorgeA.， Renye，JohnA.，Jr.，Huo, Guicheng. Journal of Food Safety, 2012, 32 (1) : 74-83.)。但是， 耐久肠球菌素Durancin GL抑菌谱较窄、活性较低。耐久肠球菌素Durancin GL的生物合 成基因（GenBank登录号HQ696461. 1)包括结构基因（durA)和免疫基因（durB)，其中结构 基因编码耐久肠球菌素Durancin GL前体，免疫基因编码耐久肠球菌素Durancin GL的免 疫蛋白以防止表达的细菌素对宿主的伤害。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供具有较宽抑菌谱、较高活性的耐久肠球菌素突变体。
[0004] 本发明的另一目的在于提供耐久肠球菌素突变体的编码基因。
[0005] 本发明的再一目的在于提供耐久肠球菌素突变体的制备方法及其在食品级防腐 剂中的应用。
[0006] 本发明的目的采用如下技术方案实现：
[0007] 耐久肠球菌素突变体，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:5所示。
[0008] 本发明还要求保护所述耐久肠球菌素突变体的编码基因。
[0009] 优选的技术方案中，所述编码基因的序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:6所示。
[0010] 本发明还要求保护含有所述编码基因的表达盒、重组载体、重组菌或细胞系。
[0011] 本发明还要求保护制备所述耐久肠球菌素突变体的方法，包括如下步骤：将携带 有耐久肠球菌素突变体编码基因的载体导入宿主菌，诱导所述宿主菌表达耐久肠球菌素突 变体。
[0012] 本发明还要求保护所述耐久肠球菌素突变体在制备食品级防腐剂方面的应用。
[0013] 本发明耐久肠球菌素突变体I30A和V31A均具有较宽抑菌谱、较高活性和稳定性， 制备方法简单，有望应用于食品级防腐剂领域。
【附图说明】
[0014] 图 1 突变质粒 pGEX-durAB-I30A 的 PCR 鉴定电泳结果，M 为 DS 5000 DNA Marker， 1为突变质粒的PCR产物。
[0015] 图 2 DE3-pGEX-durAB-I30A 的 PCR 鉴定电泳分析，M 为 DS 5000 DNA Marker，1 为 DE3-pGEX-durAB-I30A 的 PCR 产物。
[0016] 图3耐久肠球菌素Durancin GL及其突变体的抑菌活性，1为耐久肠球菌素 Durancin GL抑菌圈，2为耐久肠球菌素突变体I30A抑菌圈，3为耐久肠球菌素突变体V31A 抑菌圈。
[0017] 图4耐久肠球菌素突变体的稳定性。
[0018] 图5耐久肠球菌素Durancin GL的稳定性。
【具体实施方式】
[0019] 以下通过实施例对本发明作进一步阐述。
[0020] 实施例1
[0021] 耐久肠球菌素Durancin GL成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。其前体带 有信号肽，编码基因如SEQ ID N0:4所示。本实施例描述将SEQ ID N0:1中第30位的1(异 亮氨酸）采用A(丙氨酸）取代制备耐久肠球菌素突变体（命名为I30A)的具体方法。耐 久肠球菌素突变体I30A的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，编码基因序列如SEQ ID N0:3 所示。
[0022] 1.扩增细菌素融合基因片段
[0023] 为了便于纯化和表达，设计引物扩增制备由His标签、肠激酶酶切位点、耐久肠球 菌素Durancin GL的成熟肽编码基因（SEQ ID N0:4去除信号肽编码序列后的第85-216位 核苷酸片段）和免疫基因（durB，GenBank登录号HQ696461. 1)组成的细菌素融合基因片 段。
[0024] 针对耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因，设计引物 durl(SEQ ID N0:7)和dur2(SEQ ID N0:8)，其中引物durl带有His标签和肠激酶酶切位 点。
[0025] durl 的序列为：5，-GTGGGATCCC ACCATCATCA TCATCATGAC GACGACGACA AGGCAACTTATTATGGAAAT GGTGTTTATT G-3' ，
[0026] dur2 的序列为：5'-AAACTCGAGT TTAACTCCAAATACCGATAG ACGCCCATCC CC-3'。
[0027] 以耐久肠球菌41D株新鲜过夜培养菌液为模板，以durl和dur2为引物，扩增含 有耐久肠球菌素Durancin GL的成熟肽编码基因和免疫基因的细菌素融合基因片段。将 2. 0 y 1耐久肠球菌41D株过夜培养的菌液与25. 0 y 1HS? Mix (购自TaKaRa)、1. 0 y 1 durl、 1.0 y 1 dur2 和 21.0 yl ddH20 混合后，在 PCR 仪（Applied Biosystems)中按照下列程序 进行反应：升温至95°C维持30s ;95°C变性15s，62°C退火20s，72°C延伸60S，反应30个循 环；降温至72°C维持7min。
[0028] 2.构建携带细菌素融合基因片段的重组载体
[0029] 采用多功能DNA纯化回收试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）将细菌素融合 基因片段回收，然后与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector(购自北京全式金生物技术有 限公司）按照插入片段与线性载体物质的量之比约为7:1混匀，置于25°C下反应约10min， 获得重组质粒pEASY/durAB。
[0030] 将重组质粒 pEASY/durAB 转化到 Transl-Tl Competent E. coli (Transl-Tl 感受 态E.coli，购自北京全式金生物技术有限公司）细胞中，大量培养后提取重组质粒进行序 列鉴定。从序列鉴定正确的菌株中扩增细菌素融合基因片段，并经BamH I和Xho I双酶切， 回收酶切片段。采用BamH I和Xho I双酶切质粒pGEX-6P-l (Invitrogen)，回收载体片段。 将细菌素融合基因和载体的双酶切片段进行连接，构建重组质粒pGEX-durAB。
[0031] 3.构建表达耐久肠球菌素突变体的重组菌
[0032] 设计突变引物130六4(5￡〇10勵:9)和13(^-1?(5￡〇10勵：10)，具体序列如下 ：
[0033]I30A-F:5' -AGAAATAGGAAAAATTGCTGTTAATGGTTGGGTGCAA-3'，
[0034] I30A-R:5' -ACAGCAATTTTTCCTATTTCTTTTGAAGCTTTATTCCA-3'。
[0035] 以重组质粒pGEX-durAB为模板，以I30A-F和I30A-R为突变引物，采用Mut Express? II Fast Mutagenesis Kit(南京诺唯赞生物技术有限公司），将重组质粒 pGEX-durAB中耐久肠球菌素Durancin GL成熟肽编码基因替换为突变体的编码基因（SEQ ID N0:3)，得到突变质粒，命名为pGEX-durAB-I30A，其PCR鉴定结果如图1。将突变质粒 pGEX-durAB-I30A 转入大肠杆菌 Rosetta (DE3)，获得表达菌株 DE3-pGEX-durAB-I30A，PCR 鉴定电泳分析如图2。菌株DE3-pGEX-durAB-I30A表达耐久肠球菌素突变体I30A。
[0036] 采用上述相同方法，构建表达突变体V31A的突变重组菌DE3-pGEX-durAB-V31A。 突变体V31A是将耐久肠球菌素Durancin GL氨基酸序列（SEQ ID NO: 1)第31位V(缬氨 酸）采用A (丙氨