一种复合型纳米抑菌材料用于万古霉素耐药致病菌的治疗的制作方法
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种基于三角银纳米片的复合型纳米抑菌材料的制备及其在万古霉素耐药致病菌的治疗中的应用，属于三角银纳米片和光动力学抑菌治疗的技术应用领域。
【背景技术】
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[0002]万古霉素(Vancomycin，简称Van)是一类糖肽类抗生素，用来预防和治疗革兰氏阳性致病菌感染。由于万古霉素灭菌活性强，且不易使细菌产生耐药性，在其他抗生素无法治疗细菌感染时才被允许使用，因此被称为“抗生素的最后防线”。然而，随着万古霉素在临床上的过度使用，全世界陆续出现耐万古霉素肠球菌(Vancomycin resistantEnterococci, VRE)这一的“超级细菌”的报道。由于缺乏有效的预防措施和监管机制，VRE耐药菌株迅速波及世界各地，数量逐年增加。目前，我国VRE感染的发生率呈逐年上升趋势，个别医院中甚至高达20%，成为医院感染的主要病原菌和耐药基因的储存库。这些耐药菌株的出现和传播使得万古霉素这一治疗细菌感染的“最后防线”面临崩溃，对细菌感染的临床治疗提出了新的挑战。因此，研发新的、更加有效的抑菌方法和策略，对预防和控制VRE耐药菌的感染和传播具有重要的临床意义。
[0003]随着VRE致病菌的出现和传播，临床上治疗VRE感染的常规途径是研发新型抗生素药物用来替代原有的万古霉素。然而，新药研发工作面临投入大、周期长、风险高，难度大等诸多困难。因此，研究人员提出了一个相对简单的新药研发策略，即借助万古霉素多聚体的多价相互作用，使其与VRE细菌间形成较强的亲和力，达到有效抑制耐药细菌生长的目的。近年来，关于万古霉素多聚体的设计和抑菌活性的研究已取得的一定的成果。但是，万古霉素多聚体作为抗菌药物仍然存在一些问题。例如，并非所有万古霉素多聚体的药物效力都会随着亲和力的增加而提高，这就给万古霉素衍生物的药物研发带了极大的不确定因素。另外，即便万古霉素多聚体对VRE菌株的抑菌效力有所增强，但是持续使用仍然可能会导致新的针对该万古霉素多聚体的耐药菌株的出现。因此，寻找新的、不会产生细菌耐药性的抑菌策略仍然是耐药菌感染治疗中亟待解决的科学难题。
[0004]为了解决传统抗菌药物面临的问题，光动力学疗法(Photodynamic therapy, PDT)被引入抑菌治疗的研究中，成为治疗和控制耐药菌感染的简单有效的方法。光动力学治疗是利用一定波长的光源激活光敏剂生成活性氧分子(Reactive oxide species，R0S)损坏细菌的细胞质膜或DNA，从而达到杀灭耐药细菌的目的。与传统抗生素相比，光动力学疗法具有两大优势。第一，光动力学中两个主要因素(光和光敏剂)均没有内在的杀菌能力，杀菌活性只有通过对光敏剂处理过的区域进行光照才会产生，这样就避免了对其他正常微生物区域的破坏。第二，也是最重要的一点，细菌不会对光动力学导致的杀灭作用产生任何抵抗机制。然而，光动力学疗法作为VRE致病菌抑菌治疗的新方案仍然存在一些问题，比如，如何确保光敏剂准确靶向定位于致病菌？如何准确定位光照治疗区域？为了解决这些问题，研究人员设计合成了卟啉连接的万古霉素二聚体，利用二聚体对VRE细菌表面增强的特异性亲和能力，将光敏分子(卟啉)靶向固定到细菌表面，借助卟啉自身的荧光信号进行定位和光动力学治疗。但是卟啉连接的万古霉素二聚体作为靶向光敏药物，仍然存在以下缺陷，需要进一步的改进:(1) 二聚体合成反应耗时、产率低，且提纯过程复杂，成本高；(2) 二聚体的生物相容性差，易与血清蛋白结合形成沉淀，无法用于体内深层组织的感染治疗；(3)卟啉分子的荧光性能不佳，其近红外光源激发效率低，不适合透过皮服和组织的体内可视化治疗。因此，研发一种成本低廉、制备简单、靶向性好且具有良好生物相容性和组织透过性能的光敏复合材料用于耐药致病菌的光动力学抑菌治疗仍然是一个亟待解决的科学难题，对预防和控制耐药菌的感染和传播具有重要的临床意义。
【发明内容】
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[0005]本发明的第一个目的在于提供一种复合型纳米抑菌材料，该材料成本低、制备简单、结构稳定且具有良好的生物相容性和组织透过性能。
[0006]本发明的第二个目的在于提供上述复合型纳米抑菌材料的制备方法，该方法工艺简单、成本低廉且成功率高。
[0007]本发明的第三个目的在于提供上述复合型纳米抑菌材料在VRE耐药致病菌的光动力学可视化治疗中的应用。
[0008]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种复合型纳米抑菌材料，包括二氧化硅包裹的三角银纳米片颗粒以及修饰在颗粒表面的万古霉素-卟啉单体。
[0009]二氧化硅包裹的三角银纳米片形成核壳结构的纳米颗粒，颗粒内部的三角银纳米片可以作为基质产生的强烈的表面增强拉曼(SERS)信号，通过SERS信号有效定位病灶部位，明确光照治疗区域。包裹在外的娃球一方面有效提尚整个纳米材料的水溶性和生物相容性；另一方面作为刚性平台与万古霉素-卟啉单体偶联形成多聚模式，借助多聚体对VRE致病菌的超强的靶向结合能力，将光敏分子有效固定在细菌表面，实现靶向定位的光动力学抑菌治疗。
[0010]本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:上述复合型纳米抑菌材料的制备方法，包含以下步骤:
[0011](1)合成万古霉素-卟啉单体；
[0012](2)制备三角银纳米片(AgNPL);
[0013](3)将拉曼分子修饰到AgNPL表面；
[0014](4)在含有拉曼分子的AgNPL表面包裹一层二氧化娃，形成核壳结构的纳米颗粒(AgNPLiSi02)；
[0015](5)将万古霉素-卟啉单体修饰到AgNPL@Si02表面(AgNPLOS1 2-Por_Van)。
[0016]优先的，所述步骤(1)中，所述万古霉素-卟啉单体的合成采用氨基羧基缩合法制备。
[0017]优选的，所述步骤(2)中，所述三角银纳米片边长为20-25nm ;
[0018]优选的，所述步骤(3)中，所述拉曼分子通过共价化学键连接到三角银纳米片表面；
[0019]优选的，所述步骤(4)中，AgNPL表面包裹一层二氧化娃通过stober法完成，且水与异戊醇的比例为1:5-1:10 ；
[0020]优选的，所述步骤(5)中，万古霉素-卟啉单体以戊二酸为连接物，通过氨基羧基缩合反应修饰到AgNPL@Si02表面。
[0021]本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的:上述复合型纳米抑菌材料在万古霉素耐药菌的拉曼成像及光动力学抑菌治疗中的应用。
[0022]有益效果:本发明提供的复合型纳米抑菌材料及其制备方法，相比于现有的常规的靶向光敏抑菌药物，具有以下优点:
[0023]1、与单体万古霉素相比，万古霉素多聚模式表现出对VRE细菌表面亲和力的增加，为光敏分子的高效靶向定位提供了保障；
[0024]2、二氧化硅纳米球易被修饰，既可作为万古霉素多聚模式的连接平台，又可增加材料的水溶性和生物相容性，避免与血清蛋白结合产生沉淀，有易于体内深层组织的感染治疗；
[0025]3、与其他贵金属纳米材料相比，娃球内部的三角银纳米片具有尖锐的顶角，能够引起强局域等离子场，产生强大的电磁场增强效应，极大地放大分子的SERS信号。与传统的荧光技术定位相比，SERS信号定位不易受到样品自发荧光的干扰且没有光致褪色现象出现，并且光谱带宽狭窄，适合多组分标记。
【附图说明】
[0026]图1复合纳米抑菌材料(AgNPL@Si02-Por-Van)的制备示意图；
[0027]图2复合纳米抑菌材料的表征，包括投射电镜、光动力学散射结果及紫外-可见分光光谱图；
[0028]图3复合纳米抑菌材料及其组分的体外光动力学抑菌治疗结果；
[0029]图4复合纳米抑菌材料的体内光动力学抑菌治疗结果；
[0030]图5复合纳米抑菌材料的对耐万古霉素致病菌的拉曼成像结果；
【具体实施方式】
[0031]实施例1:
[0032]—种复合纳米抑菌材料的制备过程如下:
[0033](1)万古霉素-卟啉单体的合成:
[0034]将52.8mg万古霉素和20.8mg卟啉溶解于2mL干燥的二甲亚砜，冰浴上搅拌lOmin，然后依次加入38.0mg溶于lmLN, N-二甲基甲酰胺的0-苯并三氮卩坐-四甲基脲六氟磷酸盐和0.06mL的N，N- 二异丙基乙胺。撤去冰浴，搅拌反应过夜。反应结束时，滴加20mL丙酮，可获得深紫色固体沉淀，然后用5mL丙酮洗涤一次后经高效液相色谱分离即可获得万古霉素-卟啉单体。
[0035](2)三角银