一种agv2型环形病毒vp3可溶性蛋白及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种可溶性蛋白，具体涉及一种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白及其 制备方法。
【背景技术】
[0002] 鸡的传染性贫血病毒（CAV) -直被认为是环形病毒属中唯一成员。直到2011年， Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成 员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个新型人源环形 病毒HGyV序列。序列分析惊人发现，HGyV与AGV2的基因组序列同源性高达96%。最近， Maggi以及Biagini等人在健康人，器官移植病人以及HIV阳性病人血清样品中也检测到 HGyV/AGV2的DNA序列。在国内，叶建强等检测并首次报道了活禽市场鸡群及人血样中AGV2 的存在。这些表明AGV2具有潜在的公共卫生意义。然而目前所有的国内外对AGV2的检测 均依赖于对AGV2的病毒基因组DNA的PCR扩增，目前尚无检测AGV2蛋白抗原及其抗体的血 清学方法。对该病毒的组织嗜性、病毒蛋白表达及感染宿主中AGV2抗体水平等尚无报道。
[0003] 因此，对AGV2病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体， 实现可溶性表达，将为深入开展AGV2抗原及其抗体检测、血清学调查，明确AGV2在鸡群以 及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究VP3生物学功能具有重要意义。在 传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法 构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁 琐，效率低下。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是在于提供一种AGV2型环形病毒VP3蛋白及其制备方法。
[0005] 本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-l线性化载体 以及AGV2病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反 应，直接在体外快速重组克隆VP3,转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白 与GST的融合可溶性表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。
[0006] 实现本发明的技术方案是：
[0007] -种AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白，利用pGEX-6p-l线性化载体以及AGV2病 毒VP3基因片段的引物，利用重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组 克隆VP3,转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表 达，并获得纯化的VP3可溶性蛋白。
[0008] 进一步，所述pGEX-6p_l线性化载体是利用下述引物，以pGEX-6p_l质粒为模板， PCR扩增出pGEX-6p-l线性化表达载体；
[0009] 上游引物：5 ' -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3 ' ；
[0010] 下游引物：5 ' -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3 '。
[0011] 进一步，所述AGV2病毒VP3基因片段是利用下述引物，以PCAGV2-VP1-3质粒为模 板，PCR扩增出VP3基因片段；
[0012] 上游引物：5' -GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3' ；
[0013] 下游引物：5' -GITITCACCGTCATTACAGTCTTAGCTITT-3'。
[0014] 本发明还提供了上述AGV2型环形病毒VP3蛋白的制备方法，具体包括以下步骤：
[0015] 1)利用下述引物，以pGEX-6p-l质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-l线性化表达载 体；
[0016] 上游引物：5' -TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3' ；
[0017] 下游引物：5' -CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3' ；。
[0018] 2)利用下述引物，以pcAGV2-VPl-3质粒为模板，PCR扩增出VP3基因；
[0019] 上游引物：5' -GTTCCAGGGGCCCATGCAGACCCCCCGCTC-3' ；
[0020] 下游引物：5 ' -GITITCACCGTCATTACAGTCTTAGCTITT-3 '。
[0021] 3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物在体外进行快速重组 克隆VP3,阳性克隆经IPTG诱导表达，实现AGV2的VP3蛋白与GST的融合可溶性表达，并获 得纯化的VP3可溶性蛋白。
[0022] 本发明所述的AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白可作为AGV2诊断抗原；以及作为 免疫原获得抗VP3多克隆抗体。
[0023] 本发明与现有技术相比，其显著优点是：
[0024] 1、本发明中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTMII体外 重组技术克隆AGV2病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。
[0025] 2、本发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆方法，可快速构建AGV2病 毒VP3基因的原核可溶性表达载体。
[0026] 3、本发明获得的AGV2病毒VP3可溶性表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3可容性 蛋白作为AGV2诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展AGV2血清学流行病学 调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白；并为进一步探究VP3生物学功 能具有重要意义。
【附图说明】
[0027] 图1是本发明AGV2型环形病毒VP3可溶性蛋白的制备方法流程图。
[0028] 图2本发明PCR扩增产物的电泳分析图（泳道M表示对照品DNAMarker的电泳分 析图，泳道1、2分别代表线性化载体pGEX-6p-l以及AGV2病毒VP3片段PCR扩增产物的电 泳分析图）。
[0029] 图3是本发明AGV2病毒VP3基因的可溶性表达鉴定图（A是SDS-PAGE分析VP3 蛋白的可溶性表达：泳道1、2、3分别代表IPTG诱导的VP3超声裂解样品上清，纯化后蛋白 及超声裂解样品沉淀；泳道M为预染的蛋白分子量；B为抗GST单抗分析VP3蛋白表达：泳 道1为IPTG诱导的VP3超声裂解样品；泳道2为IPTG诱导的GST超声裂解样品）。
[0030] 图4是本发明间接免疫荧光鉴定抗VP3蛋白多克隆抗体图（A为转染 pcAGV2-VPl-3的293T细胞的间接免疫荧光结果；B为转染pcDNA3. 1载体的293T细胞的间 接免疫荧光结果）。
【具体实施方式】
[0031] 为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了AGV2新型环形病毒 VP3可溶性蛋白制备的不例。
[0032] 实施例1
[0033] 1)设计扩增pGEX-6p_l线性化载体以及AGV2病毒VP3基因片段引物：扩增 pGEX-6p-l线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位；且在5 '端带有额外TAA 碱基；扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位；且在5 '端带 有额外CAT碱基。扩增AGV2病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14 个碱基，且在5'端带有15个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补的额外碱基；扩增 AGV2病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5 '端带有 15个与pGEX-6p-l线性化载体上游引物反向互补的额外碱基