快速磁分离电化学免疫传感及检测金黄色葡萄球菌的方法
【技术领域】
[0001]
本发明提供一种快速磁分离电化学免疫传感及其对金黄色葡萄球菌高灵敏检测方法，属于生物传感技术领域。
【背景技术】
[0002]金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)是一种广泛存在于大自然的革兰氏阳性球菌。金黄色葡萄球菌肠毒素{Staphylococcus aureus Enterotoxins，SES)是一种金黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，能够导致食物中毒，可引发胸部疼痛、呕吐、腹泻、中毒休克等症状，其半数致死剂量为0.02 Pg/kg。含有较高蛋白质含量的食物如乳及乳制品，常被检测出有葡萄球菌肠毒素B (SEB)存在。SEB较稳定，经过高温数分钟加热数分钟后，仍有余留，应给予足够重视。
[0003]目前检测金黄色葡萄球菌的传统方法:平板计数法、多管发酵法与滤膜法。这三种方法都具一些共同的缺点如:检测步骤较为繁杂，检测周期较长，劳动强度较大。为适应食品工业的需要，这几年国内外发展出了几种快速检测金黄色葡萄球菌的方法如:小型生物化学测试、免疫学测试、基于核酸探针的方法、聚合酶链反应等。这些方法具有方便，快速等优点。但也存在一些缺点如:检测费用较高，对自动化的仪器依赖度较高等。而近年来，在环境监控和食品安全领域，生物传感器在病原体、有机物的检测中扮演着越来越重要的角色。鉴于其高敏感度和专一性，免疫传感已经被认为是最有效的检测工具之一。
[0004]CdTe量子点一般较为稳定，溶于水，能接受激发光产生荧光。在交联剂作用下，制备抗体功能化的量子点，可在抗体与量子点之间形成稳定的化学键，得到的连接产物结合牢固，较为稳定，可特异性检测抗原。磁性纳米球是纳米尺度的磁性材料，除了具有一般纳米粒子的光学和表面特性之外，磁性纳米球还具有催化活性，良好的磁导向，生物相溶，生物降解等性质，可与许多生物分子结合，使其表面功能化。Fe3O4是用的最多的磁性纳米球。Fe3O4粒子直径小、毒性低、灵敏度高、性能稳定、原材料易得，此外其表面积较大，表面活性也较高。因此可选择合适交联剂将特定抗体结合到磁性纳米球上，从而使磁性纳米球带有一定特殊功能。在交联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥?自酰亚胺(NHS)作用下，功能化磁性纳米球可与特定的抗原相结合，在外磁场作用力下，具有磁性的功能化生物分子可向磁场方向移动，从而集中在特定的部位。
[0005]免疫磁珠分离技术，是利用抗原(或抗体)包被的磁珠与抗体(或抗原)特异性结合，再外加磁场的作用下，可将样品从复杂基质中分离出来，达到样品富集浓缩的目的。免疫磁珠分离技术快速且特异性强，具备固相化试剂的优点，不需对待检测细菌进行增菌，有助于降低原有检测手段的检测限。从而在食品、医学等方面有其巨大的应用价值。
【发明内容】
[0006]发明的目的在于提供一种操作简单，响应时间短，价格低廉，灵敏度高以检测金黄色葡萄球菌的生物传感器。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于检测金黄色葡萄球菌的电化学生物传感器，包括辅助电极、参比电极和工作电极。其特征在于:首先分别合成了抗体功能化的磁性纳米粒子(Fe3O4-Ab)和抗体功能化的量子点(QDs-Ab)。两种功能化纳米探针同时结合到金黄色葡萄球菌表面，并通过磁场作用迅速分离，结合电化学溶出伏安方法可实现食品中金黄色葡萄球菌快速检测。
[0007]—种快速磁分离电化学免疫传感及其对金黄色葡萄球菌高灵敏检测，按照下述步骤进行:
(I) CdTe量子点的制备:
6 mM巯基丙酸(MPA)加入到2 mM CdCl2溶液中，用IM的NaOH溶液将PH调整到9.0，通入N2混合30min，再缓慢加入0.0625 M NaHTe溶液，形成暗黄色CdTe量子点。所获得的量子点溶液回流10 h，可达粒径为2.6 nm，浓度4.7 μΜ。将制成的量子点溶液通过4°C条件下15000g超滤10 min以除去过量的巯基丙酸，并反复润洗两次，最后用pH 7.4的PBS定容，并置于4 °(:的冰箱中保存。
[0008]其中步骤(I)中各反应物按照Cd2+/MPA/HTe物质量比为1:3:0.5添加。
[0009](2) CdTe量子点功能化:
取合成好的CdTe量子点溶液(4.7 μΜ),浓度为5 mg/ml的金黄色葡萄球菌抗体，以及交联试剂1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)固体颗粒，混合室温下搅拌I h，离心分离后，放置4°C的冰箱保存。
[0010]其中步骤(2)中CdTe量子点溶液/金黄色葡萄球菌抗体的体积比为15:1，金黄色葡萄球菌抗体/EDC/NHS的质量比为1:6:6。
[0011](3)磁性纳米球功能化:
按照体积比为15:1取实验室制备好的PBS缓冲溶液(pH 7.4)，浓度为5 mg /mL金黄色葡萄球菌抗体，Fe3O4固体粉末以及交联剂1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，在室温下混合反应I h，离心分离后放置4°C的冰箱保存。
[0012]其中步骤(3)中PBS缓冲溶液(pH 7.4) /金黄色葡萄球菌抗体的体积比为15:1，金黄色葡萄球菌抗体/Fe3O4固体粉末/ EDC的质量比为1:6:6。
[0013](4)工作电极预处理:
将裸电极依次用去离子水、无水乙醇和去离子水分别超声10 min，再依次用粒径为Iμπι、0.3 μπι、0.05 ym的氧化铝粉末反复打磨至镜面，然后分别置于乙醇、去离子水中超声清洗10 min，最后用氮气吹干备用。
[0014](5)工作电极的修饰以及传感器的制备:
取37°C条件下培养，经梯度稀释后的金黄色葡萄球菌，加入步骤(3)抗体功能化磁珠(Fe3O4-Ab)，室温下加入转子搅拌反应1min后，加入步骤(2)抗体功能化的量子点(QDs-Ab)，室温下反应30 min。反应结束之后，取出转子，在磁铁上静置吸附20 min。用移液枪小心取出上层清液，并加入试验室自制HNO3 (0.1 M)，并超声40 min。
[0015]其中金黄色葡萄球菌、Fe3O4-Ab、QDs-Ab以及HNO3各体积比为2:1:1:2.5，用PBS清洗电极表面后，将其浸入1~2 mL HAC/NaAC (pH 4.6)溶液中，转子搅拌均匀。
[0016]上述的快速磁分离电化学免疫传感及其对金黄色葡萄球菌高灵敏检测，其特征在于:快速磁分离电化学免疫传感器工作曲线的建立以及快速磁分离电化学免疫传感器对实际牛奶样品的检测。所制备的快速磁分离电化学免疫传感器工作曲线为:当金黄色葡萄球菌浓度为 2.21 XlO2 ~2.21 X 17 CFU mL 1 时，其线性方程为:y = 0.9934x - 0.3526，检测限为:83 CFU mL ^所制备的快速磁分离电化学免疫传感器其性能还包括良好的特异性，重复性和稳定性以及对实际牛奶样品的检测。
[0017]原理:本发明通过水相法成功制得CdTe量子点，随后又分别对量子点以及磁性纳米球进行功能化。功能化的量子点与磁性纳米球能够特异结合金黄色葡萄球菌，形成三明治结构的待检测复合物。在试管底部外加磁场，此复合物在底部富集，通过除去上清液及适当洗涤，目标物可与杂质彻底分离，随后再进行SWV电化学检测。根据所得数据可获得标准曲线和线性方程，间接测定待测样品中金黄色葡萄球菌的浓度，如图1、图2和图3所示。
[0018]与现有技术相比，本发明的优点在于:
(I)纳米材料比表面积大，表面活性位点较多，生物亲和性强，可用来做载体吸附或支撑免疫分子，有利于提高传感器诸多性能。免疫纳米磁珠和量子点主要通过免疫识别，对菌体进行捕获，在磁场作用下快速分离，不破坏菌体生物学活性。另外抗原-抗体特异性结合决定了免疫传感器的高灵敏度，特异性强，不受其他物质的干扰。磁分离以及电化学检测过程也是快速、简单。整个操作过程，简便快速，实用性好，灵敏度高，为检测食物中是否含有超标的金黄色葡萄球菌提供了另一种安全有效的新方法。
[0019](2)本实验将纳米技术与电化学免疫技术相结合，并通过快速磁分离，对牛奶中的金黄色葡萄球菌进行定量检测，具有很好的特异性。相比于传统的微生物学方法，该技术用于食品中金黄色葡萄球菌的检测大大缩短了分析时间、操作简单，能够更好的满足食品卫生、饮水安全、环境保护和控制传染病等领域中快速检测金黄色葡萄球菌的要求。
【附图说明】
[0020]图1快速磁分离电化学免疫传感器的制备及其对金黄色葡萄球菌的检测原理图； 图2检测不同浓度金黄色葡萄球菌的SWV曲线图(a) 0，(b) 2.2X 12, (c) 2.2X103，
(d) 2.2X 14, (e) 2.2X105，(f) 2.2X106，(g) 2.2X 17 CFU*mL S图3不同浓度金黄色葡萄球菌SWV峰电流的标准曲线图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述，具体操作方法如下:
(I)CdTe量子点的制备
26 μ? 6 mM巯基丙酸(MPA)加入到50 mL 2 mM CdCl2溶液中，用IM的NaOH溶液将pH调整至IJ 9.0，通入N2混合30min，再缓慢加入0.8 mL 0.0625 M NaHTe溶液，形成暗黄色CdTe量子点。Cd2+/MPA/The物质量比为1:3:0.5。所获得的量子点溶液回流10 h，可达粒径为2.6 nm，浓度4.7 μΜ。将制成的量子点溶液通过4°C条件下15000g超滤10 min以除去过量