一种酶联免疫分析定量方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种酶联免疫分析定量方法，属于分析化学和纳米技术领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，各种传染性疾病(如SARS，禽流感病毒，埃博拉病毒等)在全球范围内频繁 地爆发，已经严重影响到人们的正常生活，也得到了世界各国政府和人民的广泛关注。而及 早地诊断发现这些传染性病毒，隔离患者，不仅有利于患者及时接受相应的治疗，更有利于 防止疾病在人群中大规模传播。目前常用的检测方法有：放射免疫分析、酶联免疫吸附测 定、电化学分析方法等。这些方法都需要运用到大型仪器辅助，设备较昂贵、成本高、操作复 杂、费时。而且往往都需要受过专门培训的技术人员才会使用，难以在基层医疗单位普及推 广，更不适合于人群的肿瘤筛查。
[0003] 可视化检测因为可提供肉眼识别的信号，不需要大型仪器辅助，适用于实时、现场 检测等优点受到了广泛关注。传统的可视化酶联免疫吸附法，通常只能产生一种颜色变化， 当目标物浓度加大时，溶液颜色随之加深。我们知道，人类肉眼对颜色的变化比较敏感，但 对于同一种颜色的深浅变化并不敏感，因此传统的ELISA通常只能通过肉眼对目标物进 行定性分析，若需要对目标物进行定量测定通常需要借助一些大型仪器比如酶标仪才能实 现。
[0004] 金属纳米粒子有着强的依赖距离的光学性质以及高的消光系数，其中，金纳米粒 子是最常用的一种金属纳米颗粒，它的消光系数很高，比有机颜料高出3-5个数量级，同 时，它还有具有依赖距离的光学特性，分散的金纳米颗粒呈红色，而聚集在一起时呈蓝色或 紫色。因此金纳米颗粒经常被用于构建比色法传感器。
[0005] 然而，传统的可视化酶联免疫吸附法仅具有无色到有色的单一颜色变化，纳米金 颜色变化仅有两到三种，只能进行半定量分析，无法真正做到对目标物的定量分析检测。因 此，申请人进行了专项研究，找到了一种能产生多种颜色变化的特异性识别元件，并运用于 目标物的定量分析检测。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有仪器操作复杂、价格昂贵，传统可视化酶联免疫吸附法显色单一、 定量效果差等问题，提出一种快速、灵敏、多色彩可视化定量检测分析方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明所述的一种酶联免疫分析定量方法，利用 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)与H202在辣根过氧化物酶（HRP)催化作用下，加入酸终止 反应后所得到的产物（TMB 2+)与金纳米棒混合所产生的显色差异，从而表现出溶液颜色和紫 外吸收光谱图特征随目标物浓度变化，能够用于目标物的可视化定量测定。
[0008] -种酶联免疫分析定量方法包括以下步骤： (1) 向包被有目标捕获抗体的酶标板中加入能与之特异性结合的待测物质； (2) 向步骤（1)中加入酶标记的100 yL检测抗体反应1~2 h ; (3) 向步骤（2)中加入100 yL显色液进行显色反应10~40min，加入50 yL终止液 终止反应； (4) 向步骤（3)所得到的反应液中加入150 yL 0.69 mM金纳米棒溶液，混匀反应2~5 min后，使用数码相机记录下溶液的颜色； (5) 将步骤（4)所测定的溶液颜色与标准比色卡对比，计算得到相应目标物的浓度。
[0009] 步骤（1)、（2)中的捕获抗体、检测抗体均为ELISA检测方法中所涉及的抗原和抗 体；与目标物结合方式为改良的双抗夹心法。
[0010] 步骤（1)中所测定的待测物质中，需要有至少一个已知浓度的目标物标准品。
[0011] 步骤（1)、（2)中包括用洗涤液进行洗涤的步骤；所述的洗涤液为ELISA检测常用 洗涤液。
[0012] 步骤（2)中的酶标记的检测抗体为辣根过氧化酶（HRP)标记的抗体；所述的辣根 过氧化酶标记的抗体能够与待测物特异性结合。
[0013] 步骤（2)中的酶联免疫孵化时间为1~2 h，优选1 h。
[0014] 步骤（3)中的显色液为TMB/H202显色液，反应时间为10~40 min,优选30 min。
[0015] 步骤（3)中的终止液为HC1溶液，其中盐酸的浓度为1~4 M，优选2 M。
[0016] 步骤（4)中的金纳米棒溶液的制备方法为种子介导合成法，金纳米棒溶液的长径 比为2~10之间。
[0017] 步骤（5)中的标准比色卡的建立方法为：在含有9 mU/mL的辣根过氧化物酶（HRP) 的2 ml TMB/H202显色液中酶促反应5 min，加入1 ml 2 M HC1溶液终止反应，所得到的产 物TMB2+，用紫外分光光度计测定TMB2+的浓度，其中TMB 2+的摩尔吸光系数e = 5. 9 X 10 4 M 1 cm \均等稀释所得的产物TMB2+，得到不同浓度的TMB2+溶液并与步骤（4)中的金纳米棒 反应2 min后，用数码相机记录下此时溶液的颜色，得到已知不同浓度的TMB2+数值所对应 的不同颜色的溶液，并且具有良好的线性关系。
[0018] 步骤（5)中的标准比色卡，溶液的颜色实际上是跟生成的TMB2+具有良好的线性关 系的，当金纳米棒的用量固定时，标准比色卡所对应的TMB 2+的浓度值是一定的，不受温度 和反应时间的影响，因此具有良好的通用性和稳定性。
[0019] 步骤（5)中的所测定的目标物的颜色与标准比色卡对比，首先挑选所测定的目标 物的颜色与标准比色卡最为接近的颜色，此颜色所对应的TMB 2+浓度作为选定值，若所测定 的目标物的颜色在标准比色卡中两个颜色之间，则取两个颜色所对应的tmb2+浓度的平均 值作为选定值。
[0020] 步骤（5)中目标物浓度计算公式为：
其中Cr(CEA)为未知样品浓度，Cs(CEA)为标准品浓度，Cr(TMB2+)为未知样品与标准比 色卡对比之后所得到的TMB2+的浓度，Cs(TMB 2+)为标准品与标准比色卡对比所得到的TMB2+ 的浓度。
[0021] 本发明的有益效果： (1)纳米金棒的制备方法比较成熟，而且材料的LSPR峰在600~900 nm连续可调，这一 范围是理想的光学传感区域； (2) 以HRP作为信标分子的修饰方法，已经实现商业化，该产品方便易得，并且目前大 多数ELISA检验方法中所使用的信号标记物大多是HRP; (3) TMB/H202显色液因其无致癌性、稳定性好等优点，已经广泛地运用到ELISA检验方 法中； (4) ELISA方法是较为经典的生物样品检测方法，具有普遍的适用性，易于实现； (5) 本发明实现了多种颜色(红棕色、灰色、绿色、蓝色、紫色、粉红色、无色、黄色等）变 化，解决了传统比色方法中颜色变化单一的缺点，能够实现对目标物的定量检测，并且反应 时间快，效果好； (6) 本发明适用于目前大部分商业上已有的以HRP为信号标记物的ELISA检测试剂盒。
【附图说明】
[0022] 图1为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应所得到的标准比色卡；其中TMB 2+浓度 依次为al~a6: 0，7. 27，14. 5，21.8，29. 1，36. 3 yM (溶液颜色分别为：红棕色，淡红 棕色，棕灰色，灰色，灰绿色，绿色）；bl~b6: 43. 6，50. 9，58. 1，65. 4，72. 7，79. 9 yM (溶液颜色分别为：深蓝绿色，蓝绿色，蓝色，蓝紫色，蓝紫红色，紫色）；cl~c6: 87. 2，94. 5， 102，109，116，124 yM (溶液颜色分别为：紫红色，浅紫红色，粉红色，淡粉红色，淡粉红 色偏白，淡粉红色偏无色）；dl~d6: 131，138，145，153，160，167 yM (无色，浅黄色， 浅黄色逐渐加深等)。
[0023] 图2为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应的紫外图及线性图；其中TMB 2+浓度依次 为 0，7.27，14.5，21.8，29.1，36.3，43.6，50.9，58.1，65.4，72.7，79.9 yM (图 右侧箭头)，87. 2，94.5，102，109，116，124，131 yM (图中间箭头)，138，145，153， 160，167 yM(图左侧箭头)。其中a为不同浓度的TMB2+与金纳米棒反应后的紫外图；b为 不同浓度的TMB 2+与金纳米棒的纵向等离子吸收峰位置的线性图；c为不同浓度的TMB 2+与 金纳米棒在A= 527 nm处吸光度的线性图；d为不同浓度的TMB2+在A = 450 nm处吸光 度的线性图。
[0024] 图3为金纳米棒与不同浓度的TMB2+反应所得到的TEM图与粒径分布图。其中溶 液颜色a为红棕色，b为棕灰色，c为灰色，d为蓝色，e为蓝紫色，f为淡粉红色。
[0025] 图4为标准实